Tin tức

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu và JavaScript.
Tế bào ung thư đã phát triển các cơ chế khác nhau để vượt qua căng thẳng tế bào và tiếp tục tiến triển.Protein kinase R (PKR) và chất kích hoạt protein của nó (PACT) là những phản ứng ban đầu theo dõi các tín hiệu căng thẳng khác nhau dẫn đến ức chế sự tăng sinh tế bào và quá trình chết rụng.Tuy nhiên, việc điều hòa con đường PACT-PKR trong tế bào ung thư vẫn chưa được biết rõ.Ở đây, chúng tôi phát hiện ra rằng RNA dài không mã hóa (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) tham gia trực tiếp vào việc ức chế con đường PACT-PKR và thúc đẩy sự tăng sinh tế bào ung thư.Sử dụng tầm soát chức năng quy mô lớn của lncRNA liên quan đến ung thư CRISPRi 971, chúng tôi nhận thấy rằng DARS-AS1 có liên quan đến sự tăng sinh tế bào ung thư được tăng cường đáng kể.Do đó, DARS-AS1 loại trực tiếp ức chế sự tăng sinh tế bào và thúc đẩy quá trình tự chết của tế bào ung thư trong các dòng tế bào ung thư khác nhau trong ống nghiệm và làm giảm đáng kể sự phát triển của khối u trong cơ thể sống.Về mặt cơ học, DARS-AS1 liên kết trực tiếp với vùng hoạt hóa PACT và ngăn cản tương tác PACT-PKR, do đó làm giảm hoạt hóa PKR, phosphoryl hóa eIF2α và ức chế quá trình chết của tế bào apoptotic.Về mặt lâm sàng, DARS-AS1 được biểu hiện rộng rãi trong nhiều bệnh ung thư và sự biểu hiện quá mức của lncRNA này là dấu hiệu của một tiên lượng xấu.Nghiên cứu này làm sáng tỏ quy định cụ thể của ung thư đối với con đường PACT-PKR bởi DARS-AS1 lncRNA và cung cấp một mục tiêu khác cho tiên lượng và điều trị ung thư.
Khả năng thích ứng với căng thẳng là một đặc tính quan trọng của sự tồn tại và tăng sinh của tế bào ung thư.Sự phát triển nhanh chóng và dấu hiệu chuyển hóa của ung thư đạt đỉnh điểm trong môi trường vi mô khắc nghiệt — thiếu hụt chất dinh dưỡng, thiếu oxy và pH thấp — có thể kích hoạt các đường dẫn tín hiệu chết tế bào.Sự điều hòa của các gen nhạy cảm với căng thẳng như p535, protein sốc nhiệt 6, 7, KRAS8, 9 và HIF-110, 11, 12, 13 thường được quan sát thấy trong bệnh ung thư, do đó ngăn chặn quá trình chết theo phương pháp apoptosis và thúc đẩy sự sống sót.
Protein kinase R (PKR) là một cảm biến căng thẳng quan trọng và kinase tiểu đơn vị của yếu tố khởi động sinh vật nhân chuẩn 2α (eIF2α), một chất điều hòa dịch mã liên kết căng thẳng tế bào với sự chết của tế bào.PKR ban đầu được xác định là một protein kháng vi-rút bằng cách phát hiện ra RNA sợi đôi ngoại lai (dsRNA).Khi được kích hoạt, PKR phosphoryl hóa eIF2α để ức chế sự tổng hợp protein của tế bào và virus. 14,15,16.PACT (protein hoạt hóa PKR) đã được xác định là protein hoạt hóa PKR đầu tiên khi không có dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Thông qua tương tác trực tiếp với PKR, PACT truyền các căng thẳng khác nhau (đói huyết thanh, xử lý bằng peroxide hoặc arsenit) đến PKR và các con đường tín hiệu xuôi dòng.Ngoài sự phosphoryl hóa eIF2α, kích hoạt PKR qua trung gian PACT gây ra các sự kiện khác nhau liên quan đến phản ứng căng thẳng, bao gồm trạng thái oxy hóa khử bị thay đổi thông qua con đường PI3K / Akt24, tăng cường kiểm tra tổn thương DNA thông qua p5325,26 và NF-κB27,28 Điều chỉnh phiên mã, 29. Với vai trò quan trọng của chúng trong phản ứng căng thẳng, tăng sinh, apoptosis và các quá trình tế bào quan trọng khác, PKR và PACT là những mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn cho nhiều bệnh, đặc biệt là ung thư.Tuy nhiên, bất chấp ý nghĩa sinh học và chức năng đa hướng này, việc điều chỉnh hoạt động PACT / PKR trong tế bào ung thư vẫn còn khó nắm bắt.
lncRNA là những phiên mã lớn hơn 200 nucleotide không có khả năng mã hóa protein.Kể từ khi các dự án giải trình tự toàn bộ bộ gen tiên tiến đã xác định được hàng nghìn lncRNA, 35,36 nỗ lực đã được thực hiện để làm sáng tỏ các chức năng sinh học của chúng.Ngày càng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng lncRNA có liên quan đến nhiều quá trình sinh học37 bao gồm quy định sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X38,39, dấu ấn 40, phiên mã41,42, dịch mã43 và thậm chí cả sự phát triển ung thư44,45,46,47.Những nghiên cứu này báo cáo rằng nhiều lncRNA có liên quan đến con đường PACT / PKR.Một nghiên cứu như vậy cho thấy lncRNA ASPACT ức chế phiên mã PACT và tăng khả năng giữ nhân của mRNA PACT.Các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng lncRNA nc886 liên kết với PKR và ức chế sự phosphoryl hóa của nó 49,50.Cho đến nay, lncRNA điều hòa hoạt hóa PKR qua trung gian PACT vẫn chưa được báo cáo.
RNA đối kháng Aspartyl-tRNA synthetase RNA 1 (DARS-AS1) đã được xác định là lncRNA gây ung thư 51,52,53,54.Thông qua việc điều chỉnh miP-194-5p53, miP-12952 và miP-532-3p51, DARS-AS1 đã được chứng minh là có thể thúc đẩy sự phát triển của ung thư biểu mô tế bào thận tế bào rõ, ung thư biểu mô tuyến giáp và ung thư biểu mô phổi không phải tế bào nhỏ.Tong và các đồng nghiệp cũng phát hiện ra rằng DARS-AS1 thúc đẩy sự tiến triển của u tủy bằng cách duy trì sự ổn định của mô-típ liên kết RNA của protein 39 (RBM39).Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào được tiến hành về việc liệu lncRNA này có liên quan đến việc điều chỉnh sự hoạt hóa PACT-PKR và phản ứng căng thẳng của tế bào ung thư hay không.
Ở đây, chúng tôi đã thực hiện một màn hình mất chức năng quy mô lớn bằng cách sử dụng hệ thống CRISPRi và xác định rằng DARS-AS1 lncRNA thúc đẩy sự gia tăng của một số loại tế bào ung thư.Ngoài ra, chúng tôi đã xác định được một cơ chế chính: DARS-AS1 liên kết trực tiếp với PACT, ức chế liên kết PACT và PKR, ngăn cản quá trình phosphoryl hóa eIF2α, một chất nền PKR thấp hơn, và cuối cùng là ức chế sự chết của tế bào apoptotic.Tóm lại, công trình nghiên cứu của chúng tôi cho thấy DARS-AS1 lncRNA như một chất điều hòa con đường PACT-PKR và là mục tiêu tiềm năng để điều trị và tiên lượng ung thư.
Các nghiên cứu tổng hợp bộ gen mở rộng đã xác định được hàng trăm lncRNA có liên quan đến ung thư.Tuy nhiên, chức năng của chúng phần lớn vẫn chưa được biết đến56.Để xác định các ứng cử viên lncRNA đầy hứa hẹn liên quan đến sự tiến triển của ung thư, chúng tôi đã thực hiện một màn hình mất chức năng để giảm sự tăng sinh trong dòng tế bào ung thư đại trực tràng SW620 bằng cách sử dụng hệ thống CRISPRi (Hình 1a).Điểm độc đáo của dòng tế bào ung thư ruột kết SW480 và SW620 là chúng có nguồn gốc từ các khối u nguyên phát và thứ phát trên một bệnh nhân.Điều này cung cấp một so sánh có giá trị để nghiên cứu những thay đổi di truyền trong sự tiến triển của ung thư ruột kết giai đoạn cuối.Do đó, chúng tôi đã phân tích các bản sao của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng (SW480 và SW620) bằng cách sử dụng trình tự RNA và thu thập một số lncRNA chức năng tiềm năng từ các tài liệu đã xuất bản.Dựa trên những kết quả này, chúng tôi đã thiết kế một thư viện sgRNA tổng hợp chứa 7355 oligos sgRNA nhắm mục tiêu đến 971 lncRNA liên quan đến ung thư và 500 oligos sgRNA không được nhắm mục tiêu để kiểm soát âm tính (Dữ liệu bổ sung 1).
Biểu diễn sơ đồ sàng lọc bằng hệ thống CRISPRi.b Làm giàu sgRNA sau khi sàng lọc.Đường chấm ngang thể hiện log2 (thay đổi nếp gấp) = ± 0,58.Đường chấm dọc cho biết giá trị p = 0,05.Các chấm đen đại diện cho sgRNA không đích (được chỉ định là NC).Các chấm đỏ là sgRNA đang nhắm mục tiêu DARS-AS1.Các chấm màu xanh lam là các sgRNA nhắm mục tiêu đến LINC00205, một lncRNA gây ung thư được mô tả trước đây.lần thay đổi = (đọc bình thường, ngày 17) / (đọc bình thường, ngày 0).c DARS-AS1 sgRNA hạ gục ức chế sự phát triển của tế bào.Các thanh lỗi đại diện cho ± độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 Kiểm định t của Sinh viên hai phía.d Biểu hiện DARS-AS1 trong khối u (bộ dữ liệu TCGA).Biểu hiện của DARS-AS1 trong các mẫu khối u và bình thường được ghép đôi từ bệnh nhân mắc BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, và COAD tương ứng (bộ dữ liệu TCGA).giá trị p thu được bằng cách sử dụng phép thử t của Student hai phía được ghép nối.
Sau khi xây dựng plasmid và đóng gói lentivirus, chúng tôi đã chuyển nạp dòng tế bào ung thư đại trực tràng dCas9-SW620 với thư viện trên trong bốn thí nghiệm lây nhiễm độc lập.Sự đa nhiễm trùng (MOI) đối với những bệnh nhiễm trùng này là 0,1–0,3, cho thấy rằng mỗi tế bào chỉ có thể được truyền một sgRNA.Sau 18 ngày nuôi cấy trong ống nghiệm, cấu hình làm giàu của sgRNA mục tiêu giảm hoặc tăng lên sau khi sàng lọc, trong khi số lượng oligonucleotide đối chứng không nhắm mục tiêu vẫn tương đối không thay đổi so với cấu hình trước sàng lọc, cho thấy mục tiêu của chúng tôi có tính đặc hiệu cao. thư viện.Cơm.1b và bảng phụ 1). LINC00205, trước đây đã được báo cáo là thúc đẩy tiến triển ung thư phổi và ung thư gan58,59,60, đã được sàng lọc (log2 (foldchange) <−0,58, giá trị p <0,05), khẳng định độ tin cậy của sàng lọc này (Hình 1b). LINC00205, trước đây đã được báo cáo là thúc đẩy tiến triển ung thư phổi và ung thư gan58,59,60, đã được sàng lọc (log2 (foldchange) <−0,58, giá trị p <0,05), khẳng định độ tin cậy của sàng lọc này (Hình 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, được báo cáo trước đây là thúc đẩy sự tiến triển của ung thư phổi và ung thư gan58,59,60, đã bị loại trừ (log2 (thay đổi lần) <-0,58, p-value <0,05), xác nhận tính mạnh mẽ của sàng lọc này (Hình. 1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1b）。 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, được báo cáo trước đây là thúc đẩy tiến triển ung thư phổi và ung thư gan 58,59,60, đã bị loại trừ (log2 (thay đổi lần) <-0,58, p-value <0,05), khẳng định tính mạnh mẽ của sàng lọc này (Hình. 1b).
Trong số tất cả các lncRNA được thử nghiệm, DARS-AS1 cũng đã được sàng lọc, với ba oligonucleotide cognate sgRNA giảm đáng kể sau 18 ngày nuôi cấy, cho thấy rằng việc loại bỏ lncRNA này dẫn đến giảm sự tăng sinh ung thư (Hình 1b).Kết quả này được hỗ trợ thêm bởi phân tích MTS trong các tế bào ung thư đại trực tràng cho thấy rằng tốc độ phát triển của các tế bào hạ gục DARS-AS1 chỉ giảm một nửa so với các tế bào đối chứng (Hình 1c) và phù hợp với các báo cáo trước đây về một số loại ung thư khác.: ung thư thận tế bào rõ, ung thư tuyến giáp và ung thư phổi không tế bào nhỏ 51,52,53,55.Tuy nhiên, chức năng và cơ chế phân tử của nó trong ung thư đại trực tràng vẫn chưa được khám phá.Do đó, chúng tôi đã chọn lncRNA này để nghiên cứu thêm.
Để nghiên cứu biểu hiện DARS-AS1 ở bệnh nhân, chúng tôi đã phân tích toàn diện 10.327 mẫu khối u từ dự án Bản đồ bộ gen ung thư (TCGA).Kết quả của chúng tôi cho thấy DARS-AS1 được biểu hiện rộng rãi và điều tiết đáng kể trong các tế bào khỏe mạnh trong nhiều loại khối u, bao gồm ung thư biểu mô tuyến ruột kết (COAD), ung thư biểu mô tế bào trong thận (KIRC) và ung thư biểu mô tế bào nhú thận (KIRP)..Rất ít (Hình 1d và Hình bổ sung 1a, b). Phân tích các mẫu khối u / khỏe mạnh được ghép nối tiếp tục khẳng định biểu hiện DARS-AS1 cao hơn đáng kể trong các khối u của ung thư biểu mô bàng quang (BLCA), ung thư biểu mô tế bào trong thận (KIRC), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PRAD), ung thư biểu mô tế bào vảy phổi (LUSC) , ung thư biểu mô nội mạc tử cung (UCEC), ung thư biểu mô tuyến phổi (LUAD), ung thư biểu mô tế bào gan (LIHC), ung thư biểu mô tế bào nhú thận (KIRP) và ung thư biểu mô tuyến ruột kết (COAD) (giá trị p <0,05) (Hình 1e – m) . Phân tích các mẫu khối u / khỏe mạnh được ghép nối tiếp tục khẳng định biểu hiện DARS-AS1 cao hơn đáng kể trong các khối u của ung thư biểu mô bàng quang (BLCA), ung thư biểu mô tế bào trong thận (KIRC), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PRAD), ung thư biểu mô tế bào vảy phổi (LUSC) , ung thư biểu mô nội mạc tử cung (UCEC), ung thư biểu mô tuyến phổi (LUAD), ung thư biểu mô tế bào gan (LIHC), ung thư biểu mô tế bào nhú thận (KIRP) và ung thư biểu mô tuyến ruột kết (COAD) (giá trị p <0,05) (Hình 1e – m) .Phân tích các mẫu khối u / khỏe mạnh được ghép đôi cũng xác nhận biểu hiện DARS-AS1 cao hơn đáng kể trong ung thư biểu mô bàng quang (BLCA), ung thư biểu mô tế bào thận và tế bào trong (KIRC), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PRAD), ung thư biểu mô tế bào vảy phổi (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , ung thư biểu mô nội mạc tử cung (UCEC), ung thư biểu mô tuyến của phổi (LUAD), ung thư biểu mô tế bào gan (LIHC), ung thư biểu mô tế bào nhú của thận (KIRP) và ung thư biểu mô tuyến của đại tràng (COAD) (giá trị p < 0,05) (Hình 1e– m).配对 健康 / 肿瘤 样本 的 分析 进一步 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上皮 癌 (BLCA) 、 肾 肾 透明 细胞 癌 (KIRC) 、 前列腺 腺癌 (PRAD) 、 肺 鳞状 细胞 癌 (LUSC) 肿瘤 中 的显 着 更高 表达 ， 子宫 体 子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺 腺癌 （LUAD） ， 肝 肝细胞癌 LIHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞 癌 （KIRP） 和 结肠 腺癌 （COAD） （p 值<0,05） （图 1e-m）.配对 健康 / 肿瘤 样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮 癌 皮 癌 皮 癌 皮 、 肾 肾 细胞 癌 细胞 癌 细胞 癌 癌 癌 腺 腺癌 (prad) 、 细胞 癌 细胞 细胞(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显 着 ， 内膜 癌 （腺癌 （luad） 肝 肝 细胞 癌 （中 显 内膜 癌 腺癌 （luad） 肝 肝 细胞 癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值 <0,05） （图 1e-m）.Phân tích các mẫu kết hợp lành mạnh / khối u đã hỗ trợ thêm vai trò của DARS-AS1 trong ung thư biểu mô bàng quang (BLCA), ung thư biểu mô tế bào thận tế bào trong (KIRC), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PRAD) và ung thư biểu mô tế bào vảy phổi (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). biểu hiện trong ung thư biểu mô tử cung (UCEC), ung thư biểu mô tuyến phổi (LUAD), ung thư biểu mô tế bào gan (LIHC), ung thư biểu mô tế bào nhú thận (KIRP), và ung thư biểu mô tuyến ruột kết (COAD) (giá trị p <0,05) (Hình 1e -m).Tổng hợp lại, những kết quả này chỉ ra rằng DARS-AS1 được biểu hiện rộng rãi và cao trong nhiều loại ung thư.
Bởi vì DARS-AS1 và DARS (gen mã hóa chuỗi antisense) chia sẻ cùng một promoter và nằm cạnh nhau, chúng tôi đã thiết kế shRNA để đánh bại DARS-AS1 một cách cụ thể chứ không phải DARS (Hình bổ sung 2a, b và Bảng bổ sung 2) .Ngoài SW620, chúng tôi cũng sử dụng ba dòng tế bào khác biểu hiện cao DARS-AS1 để nghiên cứu hiệu quả và chức năng của quá trình đánh bật shRNA (Bảng bổ sung 3).Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng cả ba shRNA được phát triển đều đạt được ít nhất 80% hiệu suất hạ gục DARS-AS1 mà không ảnh hưởng nhiều đến số lượng mRNA DARS (Hình bổ sung 2c – f).Ngoài ra, chúng tôi phát hiện ra rằng việc hạ gục DARS-AS1 với các shRNA này đã ức chế đáng kể sự phát triển tế bào ở dòng tế bào ung thư đại trực tràng SW620 (49,7%) và HCT116 (27,7%), dòng tế bào ung thư vú MBA-MD-231 (53,4%).) và dòng tế bào u gan HepG2 (giảm 92,7%), cũng như khả năng hình thành các khối cầu chưa được kiểm chứng của chúng (giảm trung bình ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% và 75,7% trên mỗi dòng tế bào) (Hình 2a, b).Trong SW620, kết quả của xét nghiệm hình thành khuẩn lạc khẳng định thêm rằng DARS-AS1 shRNA ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào với mức giảm trung bình khoảng 69,6% (Hình 2c).
Ảnh hưởng của shRNA kiểm soát và shRNA DARS-AS1 lên sự tăng sinh tế bào (a) và sự hình thành hình cầu (b) trong các tế bào SW620, HCT116, MBA-MD-231 và HepG2.c Ảnh hưởng của shRNA kiểm soát và shRNA DARS-AS1 lên sự hình thành khuẩn lạc trong tế bào SW620.Tăng sinh tế bào (d), hình cầu (e) và hình thành khuẩn lạc (f) của các tế bào SW620 biểu hiện quá mức DARS-AS1.Dữ liệu được hiển thị là trung bình ± độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 và *** p ≤ 0,001 bằng phép thử t của Sinh viên hai phía.
Để bổ sung cho các nghiên cứu về mất chức năng, tiếp theo, chúng tôi tạo ra các tế bào SW620 biểu hiện quá mức DARS-AS1 (Hình bổ sung 2g).Sự biểu hiện quá mức của DARS-AS1 làm tăng đáng kể sự phát triển của tế bào (1,8 lần), sự hình thành hình cầu không được kiểm soát (1,4 lần) và sự hình thành khuẩn lạc (3,3 lần) trong các tế bào SW620 (Hình 2d – f).Chúng tôi đã xác nhận kết quả này bằng cách sử dụng một dòng tế bào biểu hiện DARS-AS1 khác, A549.Sự tăng sinh tế bào tăng cường này do sự biểu hiện quá mức của DARS-AS1 đã được quan sát thêm ở các tế bào A549 (Hình bổ sung. 2h, i và Bảng bổ sung 3).Tổng hợp lại, những nghiên cứu được và mất này chứng minh rằng DARS-AS1 thúc đẩy sự tăng sinh tế bào ung thư trong ống nghiệm.
Để khám phá cơ chế cơ bản mà DARS-AS1 điều chỉnh sự tăng sinh tế bào, chúng tôi đã thực hiện phân tích kéo xuống RNA để xác định các đối tác liên kết protein tiềm năng của nó.Kết quả RT-qPCR cho thấy khoảng 86,2% DARS-AS1 nằm trong tế bào chất của tế bào SW620 (Hình 3a).Sau đó, DARS-AS1 hoặc pseudoRNA được đánh dấu sinh học được phiên mã trong ống nghiệm được ủ với dịch ly giải tế bào SW620, sau đó là tách SDS-PAGE.Quá trình nhuộm bạc sau đó cho thấy một dải riêng biệt (~ 38 kDa) được làm giàu đáng kể trong các mẫu kéo DARS-AS1 nhưng không phải trong các mẫu RNA hoặc hạt giả (Hình 3a).Dải này được xác định là một protein hoạt hóa PKR (PACT) bằng phương pháp khối phổ (MS) và được xác nhận thêm bằng phương pháp đánh dấu miễn dịch trong các dòng tế bào SW620, HCT116 và HepG2 (Hình 3a, b).Sự làm giàu của DARS và các protein PACT liên quan - PKR và TRBP - cũng được nghiên cứu bằng cách sử dụng phân tích RNA bằng phương pháp Western blotting (WB).Kết quả chỉ ra rằng không tìm thấy tương tác trực tiếp giữa RNA DARS-AS1 và ba protein này (Hình 3b).Tương tác cụ thể giữa DARS-AS1 và PACT đã được khẳng định thêm bằng phân tích kết tủa miễn dịch RNA (RIP), cho thấy rằng DARS-AS1 được làm giàu đáng kể trong các kháng thể chống PACT chứ không phải các RNA kiểm soát khác (Hình 3c).Để xác định xem DARS-AS1 có tương tác trực tiếp với PACT trong trường hợp không có bất kỳ thành phần tế bào nào khác hay không, một thử nghiệm giao thoa sắc ký sinh học trong ống nghiệm (BLI) đã được thực hiện bằng cách sử dụng PACT tinh khiết.DARS-AS1 hoặc RNA giả được đánh dấu biotin được cố định trên cảm biến sinh học streptavidin (SA) và sau đó được ủ trong đệm động học có chứa 1 μM PACT.Đáng chú ý, PACT liên kết mạnh mẽ với DARS-AS1 (giá trị KD ~ 26,9 nM), nhưng không bắt chước RNA (Hình 3d).Tổng hợp lại, những kết quả này chứng minh sự tương tác trực tiếp và ái lực cao giữa DARS-AS1 và PACT.
Phân tích kéo RNA xác định DARS-AS1 tương tác với PACT trong các tế bào SW620.Trên, nhuộm bạc các protein liên quan.Các bình đồ miễn dịch thấp hơn được thực hiện với kháng thể kháng PACT.b Phân tích kéo xuống RNA được thực hiện trong các tế bào HCT116 (trên cùng) và HepG2 (dưới cùng).Sự làm giàu PACT được phát hiện bằng phương pháp hấp thu miễn dịch.Các xét nghiệm kết tủa miễn dịch cRNA (RIP) được thực hiện trong các tế bào SW620 bằng cách sử dụng các kháng thể được chỉ định.d Các đường cong liên kết PACT với DARS-AS1 có chiều dài đầy đủ hoặc RNA đối chứng thu được bằng phương pháp đo giao thoa sinh học (BLI).RNA được cố định trên cảm biến sinh học streptavidin.1 μM PACT được sử dụng để đo sự liên kết.e Thử nghiệm kéo RNA được thực hiện bằng cách sử dụng DARS-AS1 có chiều dài đầy đủ được đánh dấu sinh học hoặc được cắt ngắn (trên cùng).Immunoblot hiển thị PACT nhận được (dưới cùng).f PACT được gắn cờ tinh khiết được ủ với DARS-AS1 chiều dài đầy đủ được đánh dấu sinh học hoặc được cắt ngắn (như trong e) để làm xét nghiệm RIP in vitro.RNA chiết xuất được xác nhận bởi RT-qPCR.g Ái lực tương đối của các đoạn RNA khác nhau đối với PACT thu được bằng phép đo giao thoa biolayer.Để phân tích, 100 nM RNA và 1 μM RAST đã được sử dụng.h Các xét nghiệm RIP trong ống nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng PACT được dán nhãn nguyên vẹn hoặc đã được cắt ngắn tinh khiết.RNA chiết xuất được xác nhận bởi RT-qPCR.i Tốc độ phát triển của các tế bào SW620 biểu hiện quá mức DARS-AS1, PACT hoặc cả hai.j Sự biểu hiện quá mức của DARS-AS1 có chiều dài đầy đủ hoặc bị cắt ngắn trong các tế bào SW620 có những tác động khác nhau đến sự phát triển của tế bào.k Apoptosis được phát hiện bằng cách hấp thụ miễn dịch với kháng thể chống PARP.l Knockout của DARS-AS1 gây ra quá trình apoptosis của các tế bào SW620 như được hiển thị bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy.Dữ liệu được hiển thị là trung bình ± độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001, bằng phép thử t của Sinh viên hai phía. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001, bằng phép thử t của Sinh viên hai phía. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 bằng phép thử t của Sinh viên hai phía. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 bằng phép thử t của Sinh viên hai phía.
Sau đó, chúng tôi tạo ra ba đoạn RNA DARS-AS1 được đánh dấu sinh học bằng cách phiên mã trong ống nghiệm để xác định vùng DARS-AS1 cần thiết cho liên kết PACT (Hình 3e).Kết quả phân tích RNA cho thấy mỗi đoạn có thể tương tác với PACT, nhưng vùng 3 '-đầu cuối (384–768 nucleotide được đánh dấu A3) cho thấy hơn 1–384 nucleotide được đánh dấu A1) (Hình 3e).Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy trong thử nghiệm RIP in vitro sử dụng PACT tái tổ hợp (Hình 3f).Phù hợp với những kết quả này, các thí nghiệm liên kết các đoạn RNA cố định với PACT bằng BLI cũng cho thấy PACT có ái lực cao hơn với A3 (384–768 nt) (giá trị KD khoảng 94,6 nM), trong khi hầu như không có liên kết với các khu vực khác.(Hình 3d).
Chúng tôi cũng đã kiểm tra các vùng ràng buộc liên quan trong PACT.PACT chứa ba miền chức năng, hai trong số đó là miền liên kết RNA sợi kép được bảo tồn (dsRBD) và miền thứ ba (được chỉ định là D3) hoạt động như một chất kích hoạt tương tác với protein.Để kiểm tra khả năng liên kết lncRNA của mỗi vùng, chúng tôi đã thiết kế ba đột biến loại bỏ từng vùng trong số ba vùng và thực hiện xét nghiệm RIP in vitro.Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc xóa vùng thứ ba (D3) của PACT làm giảm đáng kể sự tương tác của nó với DARS-AS1 (gấp 0,11 lần so với PACT nguyên vẹn) so với hai đột biến còn lại (Hình 3 giờ), điều đó cho thấy rằng sự phát của D3 đã tương tác với DARS.-AC1.Tổng hợp lại, những kết quả này cho thấy rằng tương tác giữa DARS-AS1 và PACT có thể xảy ra chủ yếu thông qua đầu 3 ′ của DARS-AS1 và miền D3 của PACT.
Chúng tôi lưu ý rằng DARS-AS1 không ảnh hưởng đến biểu hiện PACT và PACT không ảnh hưởng đến DARS-AS1 (Hình 3c bổ sung).Sau đó, chúng tôi đã kiểm tra tác động của PACT đối với sự phát triển của tế bào.Ngược lại với DARS-AS1, các tế bào tương đối phát triển nhanh hơn 1,5–3 lần khi PACT bị đánh sập (Hình bổ sung 3d).Kết quả của thử nghiệm hình thành khuẩn lạc chỉ ra rằng các tế bào hình thành khuẩn lạc gấp 2-3 lần sau khi xử lý shRNA với PACT (Hình 3e bổ sung).Để kiểm tra xem DARS-AS1 có điều chỉnh sự tăng sinh tế bào thông qua PACT hay không, chúng tôi đã tạo ra các tế bào SW620 biểu hiện quá mức PACT, DARS-AS1 hoặc cả hai.Sự biểu hiện quá mức của PACT cho thấy sự ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào (Hình 3i).Trong khi biểu hiện quá mức của DARS-AS1 thúc đẩy đáng kể sự tăng sinh tế bào, không có sự khác biệt đáng kể về tốc độ phát triển của các tế bào biểu hiện quá mức DARS-AS1 và PACT.Những kết quả này cho thấy PACT có thể chống lại sự gia tăng tăng sinh gây ra bởi sự biểu hiện quá mức của DARS-AS1.
Vì các vùng khác nhau của DARS-AS1 có khả năng liên kết PACT khác nhau, chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng tương đối của chúng đối với sự tăng sinh tế bào bởi sự biểu hiện quá mức khác nhau của các đoạn DARS-AS1.So với hai đoạn còn lại, DARS-AS1 biểu hiện quá mức ở đầu 3 ′ (384–768 nt), vùng liên quan đến PACT chính trong DARS-AS1, vùng có khả năng kích thích tăng sinh tế bào cao nhất (Hình 3j).Những kết quả này chỉ ra mối tương quan thuận giữa khả năng liên kết và chức năng sinh học của DARS-AS1.
PACT đã được báo cáo là một protein pro-apoptotic19.Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của DARS-AS1 đối với quá trình chết theo phương pháp apoptosis.Đúng như dự đoán, việc hạ gục DARS-AS1 đã làm tăng đáng kể sự phân cắt PARP trong các tế bào SW620 và tăng tỷ lệ tế bào dương tính với annexin V trong các dòng tế bào SW620, HCT116, HepG2 và MBA-MD-231 (Hình 3k).3).3f – h), chỉ ra rằng tác dụng chống apoptosis của DARS-AS1 trong tế bào ung thư trái ngược với chức năng gây apoptosis của PACT.Tổng hợp lại, những kết quả này cho thấy rằng cơ chế của chức năng gây ung thư DARS-AS1 có thể là thông qua sự ức chế chức năng PACT.
Tiếp theo, chúng tôi khám phá các hàm ý của liên kết DARS-AS1-PACT.PACT đã được báo cáo là kích hoạt PKR thông qua tương tác trực tiếp, sau đó tăng cường phosphoryl hóa eIF2α, gây ra sự xóa dịch mã và quá trình apoptosis17.Đầu tiên, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu DARS-AS1 có ảnh hưởng đến bản địa hóa tế bào của PACT và PKR hay không.Kính hiển vi huỳnh quang đồng bộ cho thấy PACT và PKR bắt màu cao trong các tế bào SW620 với hệ số tương quan Pearson trung bình là 0,72.Trong khi đó, sự biểu hiện quá mức của DARS-AS1 làm giảm đáng kể sự đồng nội địa hóa PACT và PKR (hệ số tương quan Pearson trung bình 0,61) (Hình 4a).Để điều tra xem liệu DARS-AS1 có thể điều chỉnh tương tác PACT-PKR hay không, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm đồng kết tủa miễn dịch (co-IP) với kháng thể chống PACT trong dịch phân ly tế bào SW620.PKR được làm giàu cao trong việc chống PACT trong các tế bào kiểm soát, trong khi sự phục hồi PKR bị giảm đáng kể trong các chất ly giải từ các tế bào biểu hiện quá mức DARS-AS1 (Hình 4b).PACT và PKR được đánh dấu tinh khiết đã được sử dụng cho các xét nghiệm liên kết protein trong ống nghiệm.Theo đó, những người cung cấp DARS-AS1 nhưng không có RNA đối chứng cho thấy tương tác PACT-PKR bị ức chế (Hình 4c).Tất cả các kết quả đều cho thấy DARS-AS1 đã làm gián đoạn liên lạc PACT và PKR.
Quan sát thấy sự đồng định vị của PACT và PKR trong các tế bào kiểm soát hoặc các tế bào biểu hiện quá mức DARS-AS1 bằng kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu.Các hạt nhân được nhuộm bằng DAPI.Kết quả thống kê thu được từ 16 bức ảnh.b Đồng kết tủa miễn dịch (co-IP) sử dụng kháng thể chống PACT trong dịch phân bào của tế bào SW620 đối chứng hoặc tế bào biểu hiện quá mức DARS-AS1.c PACT được gắn nhãn, PKR tinh khiết và được phiên mã in vitro với DARS-AS1 hoặc RNA giả được ủ để phân tích liên kết protein trong ống nghiệm.Các kháng thể chống cờ đã được sử dụng để tạo kết tủa miễn dịch.d Các khe miễn dịch với các kháng thể được chỉ định được thực hiện trong các tế bào SW620 và HCT116 được truyền với shRNA kiểm soát hoặc DARS-AS1-shRNA sau đó là đói huyết thanh.e Mức độ biểu hiện DARS-AS1 đã thay đổi độ nhạy của tế bào đối với thapsigargin.Các tế bào SW620 được truyền với DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 plasmid biểu hiện quá mức hoặc plasmid đối chứng.Tế bào được xử lý bằng thapsigargin trong 48 giờ và khả năng sống sót của tế bào được xác định bằng cách sử dụng thuốc thử MTS.f DARS-AS1 được phiên mã in vitro hoặc RNA giả và PACT tinh khiết được sử dụng để xét nghiệm kích hoạt in vitro và phát hiện immunoblot.g Các khe miễn dịch sử dụng các kháng thể này được thực hiện trên các tế bào SW620-ctrl (trái) hoặc các tế bào biểu hiện quá mức các đột biến PKR (phải).Những tế bào này sau đó được chuyển nạp bằng shRNA kiểm soát hoặc DARS-AS1-shRNA, sau đó là sự đói huyết thanh.h Đo tế bào dòng chảy cho thấy rằng sự bất hoạt của PKR đột biến đã bù đắp cho quá trình chết rụng do DARS-AS1 gây ra trong các tế bào SW620.i Các khe miễn dịch với các kháng thể được chỉ định được thực hiện trong các tế bào SW620 (trái) hoặc HCT116 (phải).Các tế bào được truyền với shRNA kiểm soát hoặc shRNA DARS-AS1 bị thiếu huyết thanh và được bổ sung chất ức chế 100 nM PKR C16 hoặc DMSO.Thanh chia độ = 5 µm.Dữ liệu được hiển thị là trung bình ± độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm.* p ≤ 0,05 Kiểm định t của Sinh viên hai phía.
Người ta thường tin rằng một khi PACT tương tác với PKR17, quá trình phosphoryl hóa PKR ở Thr451 có thể được tạo ra.Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng mức độ phosphoryl hóa PKR đã tăng lên đáng kể trong các tế bào hạ gục DARS-AS1 sau khi đói huyết thanh (Hình 4d và Hình 4a).Theo đó, chúng tôi nhận thấy rằng quá trình phosphoryl hóa eIF2α, chất nền PKR chính, cũng được tăng lên đáng kể bởi DARS-AS1 shRNA (Hình 4d và Hình 4a).Thapsigargin là một tác nhân gây căng thẳng ER khiến ER giải phóng Ca2 +.Điều trị bằng thapsigargin đã được báo cáo là gây ra sự biểu hiện và kích hoạt PACT, chất này tiếp tục tương tác và kích hoạt PKR, dẫn đến quá trình apoptosis bằng cách tăng eIF2α phosphoryl hóa 18,61.Ở đây, chúng tôi đã sử dụng thapsigargin như một chất kích thích của con đường PACT / PKR để điều tra xem liệu DARS-AS1 có thể giúp các tế bào vượt qua căng thẳng bằng cách ức chế con đường PACT / PKR hay không.Chúng tôi quan sát thấy rằng mức độ biểu hiện DARS-AS1 có tương quan thuận với khả năng kháng thapsigargin của tế bào.Các tế bào SW620 biểu hiện quá mức DARS-AS1 sống sót tốt hơn khi được điều trị bằng thapsigargin, trong khi các tế bào bị loại bỏ DARS-AS1 trở nên nhạy cảm hơn (Hình 4e).Phù hợp với những kết quả này, sự biểu hiện quá mức của DARS-AS1 làm giảm quá trình phosphoryl hóa PKR do thapsigargin gây ra (Hình 4b).Ngược lại, sau khi điều trị bằng thapsigargin, PKR và eIF2α được phosphoryl hóa ở mức độ cao hơn trong các tế bào hạ gục DARS-AS1 so với các tế bào đối chứng (Hình 4b).Điều thú vị là, thapsigargin gây ra biểu hiện DARS-AS1 theo cách phụ thuộc vào liều lượng, có thể chỉ ra chức năng chống căng thẳng của DARS-AS1 (Hình 4c bổ sung).Ngoài ra, chúng tôi đã thực hiện các xét nghiệm kích hoạt in vitro để xác nhận những quan sát này.Tóm lại, PKR được tinh sạch từ dịch ly bào bằng cách sử dụng kháng thể chống PKR, sau đó được ủ với PACT tái tổ hợp và DARS-AS1 được phiên mã trong ống nghiệm.Sau phản ứng enzym, phospho-PKR được phát hiện bằng cách sử dụng WB.Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng quá trình phosphoryl hóa PKR bị ức chế đáng kể bởi DARS-AS1, nhưng không phải bởi RNA đối chứng (Hình 4f).Các kết quả in vitro và in vivo này gợi ý rằng DARS-AS1 ức chế sự hoạt hóa PKR qua trung gian PACT.Đồng thời, chúng tôi cũng quan sát thấy sự giảm khả năng phục hồi PACT khi có sự hiện diện của DARS-AS1 (Hình 4f).Kết quả này phù hợp với kết quả của xét nghiệm liên kết protein trong ống nghiệm (Hình 4c) và một lần nữa minh họa chức năng ngăn chặn của DARS-AS1 đối với liên kết PACT-PKR.
Ser246 và Ser287 trong miền D3 của PACT được yêu cầu để kích hoạt PKR trong điều kiện căng thẳng của tế bào.Việc thay thế hai gốc serine cho alanin tạo ra PACT (mutD) đột biến, kích hoạt PKR khi không có căng thẳng và sự thay thế cho alanin (mutA) đã đảo ngược quy trình.Vì chúng tôi đã chứng minh được tầm quan trọng của miền này khi liên kết trực tiếp với DARS-AS1, chúng tôi đã tạo ra hai đột biến PACT này để kiểm tra xem liệu những phần còn lại này có thể tham gia vào tương tác với DARS-AS1 hay không.Điều thú vị là cả hai đột biến đều mất khả năng liên kết với DARS-AS1 (Hình 4d bổ sung), cho thấy rằng cấu trúc hoàn chỉnh của protein PACT có thể cần thiết để tương tác hiệu quả với DARS-AS1.
Hơn nữa, kết quả của chúng tôi cũng gợi ý rằng sự ức chế tăng sinh tế bào do DARS-AS1-shRNA gây ra có thể được khôi phục một phần bằng cách biểu hiện quá mức đột biến PACT âm tính trội (PACTmutA) hoặc đột biến PKR âm tính trội (PKRmut) (Hình bổ sung 4e. E).Sự biểu hiện quá mức của các đột biến PKR âm tính trội làm giảm quá trình phosphoryl hóa PKR gây ra bởi sự hạ gục DARS-AS1 cũng như sự phosphoryl hóa eIF2α trong các tế bào thiếu huyết thanh (Hình. 4g).Quan trọng hơn, tỷ lệ tế bào apoptotic gây ra bởi quá trình hạ gục DARS-AS1 cũng giảm ở các tế bào biểu hiện quá mức PKRmut (Hình 4h và Hình bổ sung 4g).Sự ức chế hoạt động kinase của PKR cũng làm suy yếu chức năng DARS-AS1, vì kết quả cho thấy rằng việc hạ gục DARS-AS1 hiếm khi kích hoạt quá trình phosphoryl hóa PKR và eIF2α khi tế bào được điều trị bằng chất ức chế C16 đặc hiệu PKR (Hình 4i và Hình 4h).).Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng DARS-AS1 thúc đẩy tăng sinh tế bào, ít nhất là một phần, bằng cách ức chế kích hoạt PKR qua trung gian PACT.
Để khám phá thêm vai trò của DARS-AS1 trong quá trình hình thành khối u, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm in vivo bằng cách sử dụng mô hình xenograft chuột. Kết quả cho thấy rằng việc hạ gục DARS-AS1 làm giảm đáng kể sự phát triển của khối u ở chuột (giá trị p <0,0001) (Hình 5a). Kết quả cho thấy rằng việc hạ gục DARS-AS1 làm giảm đáng kể sự phát triển của khối u ở chuột (giá trị p <0,0001) (Hình 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001). Kết quả cho thấy rằng việc hạ gục DARS-AS1 làm giảm đáng kể sự phát triển của khối u ở chuột (giá trị p <0,0001) (Hình 5a).结果 表明 ， DARS-AS1 的 敲 低 显 着 降低 了 小鼠 的 肿瘤 生长 （p 值 <0,0001） （图 5a）。结果 表明 ， DARS-AS1 的 敲 低 显 着 降低 了 小鼠 的 肿瘤 生长 （p 值 <0,0001） （图 5a）。 Đăng nhập Kết quả cho thấy DARS-AS1 hạ gục đáng kể sự phát triển khối u ở chuột (giá trị p <0,0001) (Hình 5a).Do đó, trong nhóm hạ gục DARS-AS1, đã có sự giảm đáng kể về thể tích khối u trung bình khoảng 72,9% và khối lượng khối u trung bình khoảng 87,8% (Hình 5b-d).Những kết quả này cho thấy rõ ràng rằng DARS-AS1 có thể thúc đẩy đáng kể sự phát triển của khối u in vivo.
Ảnh hưởng của quảng cáo DARS-AS1 hạ gục đối với bệnh sinh ung thư đại trực tràng ở chuột khỏa thân.Các đường cong tăng trưởng (a), kích thước khối u (b), trọng lượng (c) và hình ảnh khối u (d) được hiển thị.Các thanh lỗi đại diện cho ± SEM. n = 10. **** p <0,0001, bằng phép thử t của Student hai phía. n = 10. **** p <0,0001, bằng phép thử t của Student hai phía. n = 10. **** p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. **** p <0,0001 Bài kiểm tra t của Student hai mặt.n = 10. **** p <0,0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 **** p <0,0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 **** p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. **** p <0,0001 Kiểm tra t của Sinh viên hai phía.e Kaplan-Meier đã phân tích mối tương quan giữa mức độ biểu hiện DARS-AS1 và khả năng sống sót tổng thể ở bệnh nhân UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM và LGG.Mức độ biểu hiện DARS-AS1 cao ở bệnh nhân nằm trong nhóm 50% hàng đầu;mức độ biểu hiện DARS-AS1 thấp ở bệnh nhân nằm trong nhóm 50% dưới cùng.giá trị p được xác định bằng cách sử dụng kiểm tra xếp hạng nhật ký.f Mô hình đề xuất trong đó DARS-AS1 điều chỉnh con đường PACT-PKR và sự phát triển của khối u.
Để hiểu rõ hơn về tác động lâm sàng của DARS-AS1, chúng tôi đã kiểm tra mối tương quan giữa biểu hiện của nó và sự sống còn của bệnh nhân.Bằng cách phân tích bộ dữ liệu TCGA, chúng tôi nhận thấy rằng biểu hiện DARS-AS1 cao hơn có liên quan đến u ác tính màng bồ đào (UVM), chứng sợ sắc tố thận (KICH), ung thư biểu mô tế bào nhú thận (KIRP), u trung biểu mô (MESO), đa bội nhiễm.Tỷ lệ sống thấp hơn có liên quan đáng kể với hình thái u nguyên bào thần kinh đệm (GBM) và bệnh nhân bị u thần kinh đệm cấp độ thấp (LGG) (Hình 5e).Những kết quả này cho thấy rằng DARS-AS1 có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự tiến triển của khối u trên lâm sàng và có thể là một dấu ấn sinh học dự đoán tiềm năng trong nhiều bệnh ung thư.
Trong nghiên cứu này, bằng cách sử dụng sàng lọc chức năng CRISPRi quy mô lớn, chúng tôi xác định rằng DARS-AS1 lncRNA khắc phục được căng thẳng của tế bào ung thư bằng cách điều chỉnh hai yếu tố phản ứng với căng thẳng chính là PACT và PKR.Bằng cách tương tác trực tiếp với PACT, DARS-AS1 đã ức chế sự hoạt hóa PKR qua trung gian PACT, do đó ngăn chặn quá trình chết của tế bào apoptotic và thúc đẩy tăng sinh tế bào (Hình 5f).Việc điều chỉnh DARS-AS1 đã được quan sát thấy ở nhiều loại ung thư, cho thấy rằng chức năng thúc đẩy sự sống sót của tế bào ung thư trong điều kiện căng thẳng có thể được áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư.
PACT đã được xác định là một protein hoạt hóa PKR, và hoạt hóa PKR qua trung gian PACT đóng một vai trò quan trọng trong các phản ứng căng thẳng bằng cách điều chỉnh phiên mã, dịch mã, quá trình apoptosis và các quá trình tế bào quan trọng khác62.Trong nhiều thập kỷ, những nỗ lực đã được thực hiện để tìm hiểu quy định dành riêng cho bệnh ung thư của dòng PACT-PKR.Ở đây, nghiên cứu của chúng tôi đã tiết lộ một cơ chế điều chỉnh khác của PACT-PKR trong tế bào ung thư thông qua lncRNA DARS-AS1 của tế bào, liên kết trực tiếp với PACT, ngăn chặn tương tác PACT-PKR, ức chế kích hoạt PKR và phosphoryl hóa eIF2α, do đó ức chế quá trình chết rụng do căng thẳng và kích thích tăng sinh ung thư cuối cùng.tế bào.Khám phá này làm sáng tỏ các mục tiêu lncRNA tiềm năng để tiên lượng và điều trị ung thư.
Dữ liệu của chúng tôi cho thấy DARS-AS1 làm nhạy cảm tế bào với sự đói huyết thanh với sự gia tăng đáng kể PKR được phosphoryl hóa và eIF2α.Những kết quả này cho thấy DARS-AS1 thúc đẩy sự tồn tại của tế bào ung thư trong các điều kiện khắc nghiệt bằng cách ức chế hoạt động của PACT / PKR.Một số RNA không mã hóa khác, chẳng hạn như ASPACT và nc886, cũng tham gia vào trục PACT / PKR bằng cách giảm điều hòa mRNA PACT48 hoặc điều chỉnh quá trình tự động phosphoryl hóa bằng cách liên kết với PKR49,50,64.Trong số đó, DARS-AS1 hoạt động như một chất phá vỡ liên kết PACT-PKR.Nghiên cứu này làm phong phú thêm hiểu biết của chúng tôi về quy định trục PACT / PKR và vai trò của lncRNA trong phản ứng với căng thẳng.
PACT chứa ba miền riêng biệt.Mỗi một trong hai dsRBD đầu tiên là đủ để đạt được liên kết ái lực cao của PACT với PKR, trong khi miền thứ ba (D3) là cần thiết để kích hoạt PKR in vitro và in vivo.Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng DARS-AS1 tương tác ưu tiên với miền D3 (Hình 3h).Với kích thước lớn của lncRNA (768 nucleotide), liên kết DARS-AS1 với D3 có thể ức chế vật lý tương tác giữa vùng PACT của dsRBD và PKR, do đó ngăn chặn sự liên kết của PACT và PKR.Đột biến điểm PACT thay thế Ser246 và Ser287 trong D3 bằng alanin hoặc aspartate đã phá vỡ ái lực liên kết của nó với DARS-AS1, chỉ ra tầm quan trọng của các đặc tính điện và cấu trúc tổng thể của D3 trong sự liên kết của chúng.Trong tương lai sẽ cần thêm chi tiết về cơ chế này, sử dụng phân tích sinh hóa chính xác hơn và phân tích cấu trúc PACT độ phân giải cao.
Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng DARS-AS1 thúc đẩy tăng sinh tế bào thông qua một số cơ chế51,52,53.Trong một ví dụ, các nhà điều tra quan sát thấy rằng DARS-AS1 đã điều chỉnh gen DARS mã hóa protein antisense của nó bằng cách nhắm mục tiêu miP-194-5p trong các tế bào ung thư thận.Tuy nhiên, trong nghiên cứu hiện tại, việc hạ gục DARS-AS1 ít ảnh hưởng đến quá trình phiên mã DARS ở nhiều loại ung thư, bao gồm ít nhất là ung thư đại trực tràng, ung thư vú và ung thư gan.Bởi vì lncRNA thể hiện các mô hình biểu hiện cụ thể của tế bào và mô, các cơ chế chức năng có thể không được bảo tồn giữa các loại ung thư, điều này có thể góp phần vào sự khác biệt này giữa các quan sát của chúng tôi và các đánh giá trước đây về các loại ung thư khác nhau.Các nghiên cứu đặc biệt là cần thiết để làm sáng tỏ các cơ chế cụ thể của các quá trình sinh lý và bệnh lý khác nhau.
Một phân tích dữ liệu lâm sàng cho thấy biểu hiện DARS-AS1 trong khối u có tương quan nghịch với sự sống còn của bệnh nhân ung thư, điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của trục DARS-AS1 / PACT / PKR trong tiên lượng ung thư.Kết luận, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng DARS-AS1 là một bộ điều chỉnh trục tín hiệu PACT / PKR, thúc đẩy sự tăng sinh tế bào ung thư và ức chế quá trình chết rụng trong quá trình phản ứng với căng thẳng, cung cấp một dòng nghiên cứu khác và được quan tâm nghiên cứu trong tương lai về các phương pháp điều trị tiềm năng .
Các dòng tế bào người SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 và HEK293T được lấy từ Cơ sở hạ tầng nguồn tế bào quốc gia ở Trung Quốc.Tất cả các tế bào được duy trì trong môi trường DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) được bổ sung 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) và 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ở 37 ° C, 5% CO2.máy ấp trứng.
Chống PACT, Abcam (ab31967);Chống PKR, Abcam (ab184257);Chống PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Chống Cờ, Abcam (ab125243);Chống eIF2α, Abcam (A0764));chống eIF2α (phốt pho S51), Abcam (ab32157);chống PACT (phốt pho S246), Abgent (AP7744b);chống β-tubulin, CST (2128);IgG của chuột bình thường, CST (5415S);thỏ bình thường IgG, CST (2729S).Các kháng thể được pha loãng theo tỷ lệ 1: 1000 trong PBST đối với phương pháp thấm Western và 1: 100 đối với IP.
sgRNA được phát triển bằng cách sử dụng một công cụ công khai có tên là CRISPR-ERA66.Chúng tôi đã sử dụng các tham số công cụ mặc định để phát triển sgRNA và thuật toán đã tính toán các vị trí liên kết sgRNA trong vùng 3 kb.tập trung tại TSS.Các bể chứa oligonucleotide sgRNA được tổng hợp tại CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) và được nhân bản thành các plasmid pgRNA được nhân bản hóa (Addgene # 44248).Tổng cộng 12 µg plasmid pgRNA được nhân hóa tổng hợp, 7,2 µg psPAX2 (Addgene # 12260) và 4,8 µg pMD2.G (Addgene # 12259) đã được đồng chuyển nạp thành 5 x 106 HEK293T trong các đĩa 10 cm bằng cách sử dụng Thuốc thử chuyển gen hoàn hảo (CWBIO, Bắc Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Phần nổi có chứa vi rút được thu thập 48 và 72 giờ sau khi truyền và lọc qua màng lọc 0,45 µm.Để sàng lọc, các tế bào SW620 biểu hiện protein dung hợp dCas9 / KRAB thu được bằng cách truyền virus.Các tế bào SW620 biến đổi đã bị nhiễm thư viện vi rút trong bốn thí nghiệm lây nhiễm độc lập ở MOI 0,1-0,3 và được lấy mẫu với 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) trong 2 ngày.Sau đó, các tế bào được nuôi cấy trong ống nghiệm 18 ngày với độ phủ thư viện tối thiểu là 500 tế bào / sgRNA để sàng lọc.
DNA bộ gen được tách chiết theo hướng dẫn của QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Đức; 51183).Tổng cộng, 100 μg DNA bộ gen trên mỗi lần lặp lại sinh học đã được sử dụng để xây dựng thư viện.Vùng sgRNA được khuếch đại bởi hai vòng PCR và được liên kết với mã vạch.
Các sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cách sử dụng gel NucleoSpin® và bộ tinh lọc PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Đức; 740609.250) và được định lượng bằng bộ phát hiện DNA sợi đôi Qubit ™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Xét nghiệm MTS được sử dụng để đo sự tăng sinh của tế bào.Tế bào được gieo hạt trong đĩa 96 giếng với mật độ ban đầu là 2000 tế bào / giếng.Số lượng tế bào tương đối được đo hàng ngày tại thời điểm được chỉ định trong tổng số 4-6 ngày.Đối với mỗi giếng, 20 μl thuốc thử MTS (Promega) được pha loãng với 100 μl DMEM, ủ với các tế bào trong 4 giờ ở 37 ° C, và sau đó đo OD490.
Khả năng tăng trưởng không được kiểm chứng được phát hiện bằng cách phân tích sự hình thành các khối cầu.Tóm lại, 2000 tế bào được truyền với shRNA DARS-AS1 hoặc shRNA kiểm soát được nuôi cấy trong các vi mẫu gắn kết cực thấp (Corning) với sự thay đổi môi trường cứ 4 ngày một lần.Các khối cầu được đếm sau 14 ngày.500 tế bào được chuyển với plasmid biểu hiện quá mức DARS-AS1 hoặc plasmid đối chứng đã được sử dụng cho xét nghiệm tăng cường, nếu không thì phương pháp này không thay đổi.
RNA được phiên mã bằng cách sử dụng T7 RNA polymerase và biotin-16-UTP (Roche 1138908910) theo hướng dẫn của Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Các loại sơn lót được sử dụng ở đây được liệt kê trong Bảng bổ sung 4.
Các vùng PACT hoặc PKR mã hóa protein được nhân bản thành pET15b (Addgene # 73619) và chuyển thành BL21 (DE3).Vi khuẩn được ủ qua đêm trong LB được cung cấp ampicillin và sau đó được pha loãng 100 lần với LB mới.Khi OD600 của môi trường đạt 0,8, 1 mM IPTG được thêm vào để cảm ứng sự biểu hiện của protein.Sau khi ủ qua đêm với lắc nhẹ (250 vòng / phút ở 20 ° C), viên tế bào được thu thập bằng cách ly tâm (4000 vòng / phút, 10 phút, 4 ° C).Đặt lại viên tế bào trong dung dịch đệm ly giải (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) và ủ trên đá trong 30 phút, sau đó ngâm ủ (15 phút, 5 giây bật / tắt, trên đá) và ly tâm (13.000 vòng / phút)., 30 phút, 4 ° С).Phần nổi phía trên sau đó được nạp vào nhựa Ni-NTA (QIAGEN) 3 lần ở 4 ° C, rửa 4 lần với đệm rửa (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) và rửa giải 3 lần, với tổng trong 10 ml dung dịch đệm rửa giải (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Protein tinh khiết được xác định bằng cách sử dụng WB và nồng độ được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein Qubit ™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Các xét nghiệm RIP đã được thực hiện như đã mô tả trước đây, với các sửa đổi.Tóm lại, 1x đệm RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, chất ức chế ribonuclease RNasin (Promega), PMSF (Công nghệ sinh học Beyotime), 1 mM DDM, protease) làm kiềm tế bào 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng / phút trong 15 phút ở 4 ° C.Sau đó, phần nổi phía trên được ủ với protein A + G hạt từ tính (Millipore) kết hợp với 5 μg kháng thể chống PACT (Abeam) hoặc IgG (CST).Các hạt được rửa 5 lần với đệm RIP 5x, sau đó được tiêu hóa bằng proteinase K (NEB).RNA được chiết xuất bằng Trizol và xác định bằng RT-qPCR.Các chất mồi được trình bày trong Bảng bổ sung 5.
Xét nghiệm RIP trong ống nghiệm được thực hiện theo một quy trình xét nghiệm RIP tiêu chuẩn đã được sửa đổi.Tổng cộng 5 pmol RNA được phiên mã in vitro được pha loãng 1 lần với đệm RIP và ủ bằng cách ủ ở 65 ° C trong 5 phút, sau đó làm lạnh chậm đến nhiệt độ phòng.Tổng cộng 5 pmol protein PACT gắn cờ nguyên vẹn hoặc đột biến đã được tinh chế từ E. coli.Ủ với RNA biến tính trong 2 giờ ở 4 ° C và thực hiện theo quy trình trên để phân tích RIP cho IP chống cờ.
Đối với phân tích mở rộng RNA, tế bào 1 × 107 được ly giải với bộ đệm 1xRIP.Sau khi ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng / phút trong 15 phút ở 4 ° C, phần nổi phía trên được xử lý trước với 30 μl hạt từ tính streptavidin (Beckman) trong 2 giờ ở 4 ° C.Sau đó, lysate tinh chế được cung cấp tRNA của nấm men và được ủ với 40 pmol RNA biến tính qua đêm ở 4 ° C, sau đó trong 2 giờ nữa và 20 μl hạt từ tính streptavidin mới bị chặn bằng BSA đã được thêm vào.Bước giặt bao gồm 4 lần với bộ đệm RIP 5x và 4 lần với bộ đệm RIP 1x.Các protein tương ứng được rửa giải bằng đệm rửa giải biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) và được tách trên NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Sau khi nhuộm bạc (Công nghệ sinh học Beyotime), một số dải nhất định đã được MS cắt bỏ và phân tích.
Phân tích Co-IP được thực hiện để kiểm tra sự tương tác giữa PACT và PKR.Tóm lại, dịch ly nổi nổi được chuẩn bị bằng cách ủ 1 x 107 tế bào đã ly giải trong 1 x đệm RIP, sau đó ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng / phút trong 15 phút ở 4 ° C.Các ly giải được nạp các hạt từ tính protein A + G, được liên hợp với 5 µg kháng thể chống PACT, và quay nhẹ qua đêm ở 4 ° C.Các hạt được rửa 3 lần với đệm 5 × RIP, hai lần với đệm 1 × RIP và rửa giải bằng đệm 1 × SDS.Protein thu hồi được phân tích bằng gel SDS-PAGE và được phát hiện bởi WB.
Hai pmol PACT được gắn cờ và 1 pmol PKR đã được tinh chế khỏi E. coli.Pha loãng trong đệm RIP 1 × và ủ với 10 pmol RNA biến tính trong 2 giờ ở 4 ° C.Sau đó, chúng được ủ với kháng thể chống đánh dấu hạt từ tính liên hợp với protein A + G thêm hai giờ.Sau đó, các hạt được rửa bốn lần với đệm RIP 1x và rửa giải bằng đệm SDS 1x.Kết quả PACT và PKR đã được WB phát hiện.