Tin tức

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu và JavaScript.
Phương pháp ghi nhãn vùng lân cận bằng enzym dựa trên các este hoạt hóa hoặc gốc phenoxy được sử dụng rộng rãi để lập bản đồ các proteome dưới tế bào và các chất tương tác với protein trong tế bào sống.Tuy nhiên, các este được hoạt hóa ít phản ứng hơn, dẫn đến bán kính ghi nhãn rộng và các gốc phenoxy được tạo ra bởi quá trình xử lý peroxide có thể gây trở ngại cho các con đường oxy hóa khử.Ở đây chúng tôi báo cáo một phương pháp kích hoạt quang phụ thuộc ghi nhãn vùng lân cận (PDPL) được phát triển bằng cách liên kết về mặt di truyền của protein quang cảm quang miniSOG với một protein quan tâm.Được kích hoạt bởi ánh sáng xanh và được kiểm soát bởi thời gian tiếp xúc, oxy đơn được tạo ra và sau đó đạt được việc ghi nhãn dư lượng histidine được phân giải về mặt không gian bằng đầu dò anilin.Chúng tôi chứng minh độ trung thực cao của nó thông qua lập bản đồ proteome cụ thể cho bào quan.So sánh song song của PDPL với TurboID cho thấy mức độ bao phủ proteomic cụ thể và toàn diện hơn của PDPL.Tiếp theo, chúng tôi áp dụng PDPL cho coactivator phiên mã liên quan đến bệnh BRD4 và E3 Parkin ligase và tìm thấy các chất tương tác trước đây chưa được biết đến.Bằng cách sàng lọc biểu hiện quá mức, hai chất nền không xác định, Ssu72 và SNW1, đã được xác định đối với Parkin, mà sự suy thoái của chúng được trung gian bởi con đường phổ biến-proteasome.
Đặc điểm chính xác của mạng lưới protein làm cơ sở cho nhiều quá trình tế bào cơ bản.Do đó, lập bản đồ không gian chính xác cao về các tương tác protein sẽ cung cấp cơ sở phân tử để giải mã các con đường sinh học, bệnh lý và phá vỡ các tương tác này cho mục đích điều trị.Vì vậy, các phương pháp có khả năng phát hiện tương tác thời gian trong tế bào hoặc mô sống rất được mong đợi.Phép đo phổ khối lượng làm sạch ái lực (AP-MS) trước đây đã được sử dụng để xác định các đối tác liên kết của các protein quan tâm (POI).Với sự phát triển của các phương pháp proteomics định lượng, Bioplex3.0 đã được tạo ra, cơ sở dữ liệu lớn nhất về mạng lưới protein dựa trên AP-MS.Mặc dù AP-MS rất mạnh, các bước ly giải và pha loãng tế bào trong quy trình làm việc thiên về các tương tác liên kết yếu và thoáng qua, đồng thời đưa vào các yếu tố tạo tác sau ly giải chẳng hạn như các cặp tương tác giả thiếu sự phân chia trước khi ly giải.
Để giải quyết những vấn đề này, các axit amin không tự nhiên (UAA) với các nhóm liên kết chéo và nền tảng ghi nhãn gần đó bằng enzym (PL) (ví dụ như APEX và BioID) 5 đã được phát triển.Mặc dù phương pháp UAA đã được áp dụng thành công trong nhiều trường hợp và cung cấp thông tin về chất kết dính protein trực tiếp, nhưng vẫn cần phải tối ưu hóa vị trí chèn UAA.Quan trọng hơn, nó là một phương pháp ghi nhãn theo phương pháp đo phân vị thiếu chất xúc tác đảo ngược các sự kiện ghi nhãn.Ngược lại, các phương pháp PL bằng enzym, chẳng hạn như phương pháp BioID, hợp nhất ligase biotin được thiết kế để POI7, sau đó kích hoạt biotin để tạo thành chất trung gian este biotinyl-AMP phản ứng.Do đó, enzym sẽ xúc tác và giải phóng một “đám mây” biotin đã được kích hoạt để gắn nhãn các dư lượng lysine gần nhau.Tuy nhiên, BioID cần hơn 12 giờ để thu được tín hiệu được gắn nhãn đủ, điều này loại trừ việc sử dụng nó với độ phân giải tạm thời.Sử dụng sự tiến hóa có định hướng dựa trên hiển thị nấm men, TurboID được thiết kế dựa trên BioID để hiệu quả hơn, cho phép dán nhãn hiệu quả với biotin trong vòng 10 phút, cho phép nghiên cứu các quy trình năng động hơn.Bởi vì TurboID có hoạt tính cao và mức biotin nội sinh đủ để ghi nhãn ở mức thấp, việc ghi nhãn nền trở thành một vấn đề tiềm ẩn khi việc ghi nhãn theo thời gian và nâng cao được yêu cầu bằng cách bổ sung biotin ngoại sinh.Ngoài ra, các este hoạt hóa có phản ứng kém (t1 / 2 ~ 5 phút), có thể dẫn đến bán kính ghi nhãn lớn, đặc biệt là sau khi bão hòa các protein lân cận với biotin 5. Theo một cách tiếp cận khác, sự dung hợp di truyền của peroxidase ascorbate được thiết kế (tức là biotin- gốc phenol và cho phép ghi nhãn protein trong vòng một phút9,10. APEX được sử dụng rộng rãi để xác định các proteome dưới tế bào, phức hợp protein màng và phức hợp protein truyền tín hiệu tế bào11,12. Tuy nhiên, nhu cầu về nồng độ peroxit cao có thể ảnh hưởng đến các protein hoặc con đường oxy hóa khử, làm gián đoạn các quá trình tế bào.
Do đó, một phương pháp mới có khả năng tạo ra nhiều loài triệt tiêu bán kính được gắn nhãn phản ứng hơn với độ chính xác về thời gian và không gian cao mà không làm gián đoạn đáng kể các đường dẫn tế bào sẽ là một bổ sung quan trọng cho các phương pháp hiện có. Trong số các loài phản ứng, oxy đơn kích thích sự chú ý của chúng tôi do thời gian tồn tại ngắn và bán kính khuếch tán hạn chế (t1 / 2 <0,6 µs trong tế bào) 13. Trong số các loài phản ứng, oxy đơn kích thích sự chú ý của chúng tôi do thời gian tồn tại ngắn và bán kính khuếch tán hạn chế (t1 / 2 <0,6 µs trong tế bào) 13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Trong số các dạng hoạt động, oxy đơn thu hút sự chú ý của chúng tôi do thời gian tồn tại ngắn và bán kính khuếch tán hạn chế (t1 / 2 <0,6 µs trong tế bào) 13.在 活性 物质 中 ， 单线 态 氧 因其 寿命 短 和 扩散 半径 有限 （细胞 中 t1 / 2 <0,6 µs） 而 引起 了 我们 的 注意 13。 1/2 <0,6 µs） 而 引起 了 我们 的 注意 13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Trong số các dạng hoạt động, oxy đơn thu hút sự chú ý của chúng ta vì thời gian tồn tại ngắn và bán kính khuếch tán hạn chế (t1 / 2 <0,6 μs trong tế bào).Oxy singlet đã được báo cáo là oxy hóa ngẫu nhiên methionine, tyrosine, histidine và tryptophan, làm cho nó phân cực 14,15 để gắn vào các đầu dò dựa trên amine hoặc thiol16,17.Mặc dù oxy đơn đã được sử dụng để đánh dấu RNA ngăn dưới tế bào, các chiến lược tái định vị các dấu hiệu lân cận POI nội sinh vẫn chưa được khám phá.Ở đây, chúng tôi trình bày một nền tảng được gọi là dán nhãn vùng lân cận phụ thuộc vào hoạt động quang (PDPL), trong đó chúng tôi sử dụng ánh sáng xanh để chiếu sáng POI được kết hợp với bộ cảm quang miniSOG và kích hoạt tạo oxy đơn để oxy hóa dư lượng gần, tiếp theo là các sửa đổi có chứa amin để oxy hóa các đầu dò hóa học thành tế bào sống trung gian..Chúng tôi đã thử nghiệm một nhóm các đầu dò hóa học để tối đa hóa tính đặc hiệu của thẻ và xác định các vị trí sửa đổi bằng cách sử dụng quy trình làm việc proteomics mở.So sánh song song của PDPL với TurboID cho thấy mức độ bao phủ proteomic cụ thể và toàn diện hơn của PDPL.Chúng tôi đã áp dụng phương pháp này để đánh dấu các dấu hiệu cụ thể trên bào quan của proteome dưới tế bào và nhận dạng proteome chung của các đối tác liên kết đối với protein điều hòa biểu sinh liên quan đến ung thư BRD4 và E3 ligase Parkin liên quan đến bệnh Parkinson, xác nhận cả một mạng lưới protein đã biết và chưa biết các tương tác..Khả năng của PDPL để nhận ra các cơ chất E3 trong các phức hợp protein lớn thể hiện một tình huống mà việc nhận biết các chất kết dính gián tiếp là cần thiết.Hai cơ chất parkin chưa biết qua trung gian của ubiquitination-proteasome đã được xác nhận tại chỗ.
Liệu pháp quang động (PDT) 19 và bất hoạt bằng laser hỗ trợ mang màu (CALI) 20, trong đó chiếu xạ ánh sáng với chất cảm quang tạo ra oxy đơn lẻ, có thể làm bất hoạt các protein đích hoặc gây chết tế bào.Vì oxy đơn là một chất phản ứng cao với khoảng cách khuếch tán lý thuyết khoảng 70 nm, nên có thể kiểm soát quá trình oxy hóa giới hạn về mặt không gian xung quanh bộ cảm quang.Dựa trên khái niệm này, chúng tôi quyết định sử dụng oxy đơn để đạt được sự gắn nhãn chặt chẽ của các phức hợp protein trong tế bào sống.Chúng tôi đã phát triển một phương pháp tiếp cận protein hóa học PDPL để đáp ứng bốn chức năng: (1) xúc tác tạo ra oxy đơn hoạt tính tương tự như phương pháp tiếp cận enzym PL;(2) cung cấp ghi nhãn được giải quyết theo thời gian khi bắt đầu ánh sáng;(3) bằng cách thay đổi (4) Tránh sử dụng các đồng yếu tố nội sinh (như biotin) để giảm nền, hoặc sử dụng các thuốc thử ngoại sinh có tính biến đổi cao (như peroxit) để giảm thiểu sự tiếp xúc của tế bào với áp lực môi trường.
Chất nhạy cảm quang có thể được chia thành hai loại bao gồm các fluorophores trọng lượng phân tử nhỏ (ví dụ như hoa hồng bengal, xanh methylen) 22 và các protein nhỏ được mã hóa di truyền (ví dụ: miniSOG, KillerRed) 23.Để đạt được thiết kế mô-đun, chúng tôi đã phát triển nền tảng PDPL thế hệ đầu tiên bằng cách thêm các protein cảm quang (PS) vào POI24,25 (Hình 1a).Khi được chiếu xạ bằng ánh sáng xanh lam, oxy đơn ôxy hóa các gốc axit amin nucleophilic gần nhau, dẫn đến cực umpolung là electrophin và có thể tiếp tục phản ứng với nucleophiles của đầu dò amin16,17.Đầu dò được thiết kế với tay cầm bằng alkyne để cho phép kích hoạt hóa học và kéo xuống để xác định đặc tính LC / MS / MS.
Sơ đồ minh họa việc ghi nhãn các phức hợp protein qua trung gian miniSOG.Khi tiếp xúc với ánh sáng xanh, các tế bào biểu hiện miniSOG-POI tạo ra oxy đơn, làm thay đổi các protein tương tác nhưng không phải là các protein không liên kết.Các sản phẩm trung gian của quá trình quang oxy hóa được chặn bởi các nhãn chuyển tiếp của đầu dò hóa học amin để tạo thành các cộng hóa trị.Nhóm alkynyl trên đầu dò hóa học cho phép kích hoạt hóa học để làm giàu bằng cách kéo xuống sau đó là định lượng LC-MS / MS.b Cấu trúc hóa học của amin thăm dò 1-4.c Phân tích gel huỳnh quang đại diện của các marker proteomic qua trung gian miniSOG khu trú ty thể bằng cách sử dụng đầu dò 1-4 và định lượng tương đối dựa trên phép đo mật độ gel.Tỷ lệ tín hiệu trên nền của các đầu dò hóa học được đánh giá bằng cách sử dụng các thí nghiệm đối chứng âm tính không bao gồm ánh sáng xanh hoặc sử dụng các tế bào HEK293T không có biểu hiện miniSOG.n = 2 mẫu độc lập về mặt sinh học.Mỗi dấu chấm đại diện cho một bản sao sinh học.d Phát hiện đại diện và định lượng PDPL bằng cách sử dụng đầu dò 3 được tối ưu hóa khi có hoặc không có các thành phần PDPL được chỉ định như c.n = 3 mẫu độc lập về mặt sinh học.Mỗi dấu chấm đại diện cho một bản sao sinh học.Đường tâm và râu biểu thị giá trị trung bình và ± độ lệch chuẩn.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Hình ảnh đồng bộ của oxy đơn với vết Si-DMA màu đỏ xa.Thanh chia độ: 10 µm.Các thí nghiệm tạo ảnh gel và thí nghiệm đồng tiêu được lặp lại độc lập ít nhất hai lần với các kết quả tương tự.
Đầu tiên, chúng tôi đã thử nghiệm khả năng của các chất nhạy sáng trưởng thành miniSOG26 và KillerRed23, được thể hiện ổn định trong HEK293T, làm trung gian cho việc ghi nhãn propargylamine của proteome như một đầu dò hóa học (Hình bổ sung 1a).Phân tích huỳnh quang gel cho thấy rằng toàn bộ nhãn proteome đã đạt được bằng cách sử dụng miniSOG và chiếu xạ ánh sáng xanh, trong khi không quan sát thấy sản phẩm ghi nhãn nhìn thấy được với KillerRed.Để cải thiện tỷ lệ tín hiệu trên nền, sau đó chúng tôi đã thử nghiệm một bộ đầu dò hóa học có chứa anilin (1 và 3), propylamine (2) hoặc benzylamine (4).Chúng tôi quan sát thấy rằng bản thân các tế bào HEK293T có tín hiệu nền cao hơn so với không có ánh sáng xanh lam, có thể là do chất kích thích quang riboflavin nội sinh, flavin mononucleotide (FMN) 27. Các đầu dò hóa học dựa trên anilin 1 và 3 cho độ đặc hiệu tốt hơn, với HEK293T biểu hiện ổn định miniSOG trong ti thể hiển thị tín hiệu tăng> 8 lần cho đầu dò 3, trong khi đầu dò 2 được sử dụng trong phương pháp ghi nhãn RNA CAP-seq chỉ hiển thị ~ 2,5- tăng tín hiệu gấp, có thể là do các tùy chọn phản ứng khác nhau giữa RNA và protein (Hình 1b, c). Các đầu dò hóa học dựa trên anilin 1 và 3 cho độ đặc hiệu tốt hơn, với HEK293T biểu hiện ổn định miniSOG trong ti thể hiển thị tín hiệu tăng> 8 lần cho đầu dò 3, trong khi đầu dò 2 được sử dụng trong phương pháp ghi nhãn RNA CAP-seq chỉ hiển thị ~ 2,5- tăng tín hiệu gấp, có thể là do các tùy chọn phản ứng khác nhau giữa RNA và protein (Hình 1b, c).Đầu dò hóa học dựa trên anilin 1 và 3 cho thấy độ đặc hiệu tốt hơn: HEK293T, biểu hiện ổn định miniSOG trong ty thể, cho thấy tín hiệu tăng hơn 8 lần đối với đầu dò 3, trong khi đầu dò 2, được sử dụng trong phương pháp ghi nhãn RNA CAP-seq, chỉ cho thấy sự gia tăng tín hiệu ~ 2,5 lần, có thể là do các tùy chọn phản ứng khác nhau giữa RNA và protein (Hình 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更好 的 特异性 ， HEK293T 在 线粒体 中 稳定 表达 miniSOG ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用于 RNA 标记 方法 CAP-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5- 倍 信号 增加 ， 可能 是 由于 RNA 和 蛋白质 之间 的 不同 反应 偏好 （图 1b ， c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒 体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 - 倍 信号 增加 ， 可能 是 由于 RNAĐầu dò hóa học dựa trên anilin 1 và 3 có độ đặc hiệu tốt hơn, HEK293T biểu hiện ổn định miniSOG trong ti thể và đầu dò 3 có tín hiệu tăng hơn 8 lần, trong khi đầu dò 2 đối với phương pháp ghi nhãn RNA CAP-seq chỉ cho thấy mức tăng gấp ~ 2,5 lần.trong tín hiệu, có thể là do các sở thích phản ứng khác nhau giữa RNA và protein (Hình 1b, c).Ngoài ra, đầu dò 3 đồng phân và đầu dò hydrazine (đầu dò 5, 6, 7) đã được thử nghiệm, xác nhận tính tối ưu của đầu dò 3 (Hình bổ sung 1b, c).Tương tự, phân tích huỳnh quang trong gel cho thấy các thông số thực nghiệm được tối ưu hóa khác: bước sóng chiếu xạ (460 nm), nồng độ đầu dò hóa học (1 mM) và thời gian chiếu xạ (20 phút) (Hình bổ sung 2a – c).Việc bỏ qua bất kỳ thành phần hoặc bước nào trong giao thức PDPL dẫn đến sự đảo ngược tín hiệu đáng kể về nền (Hình 1d).Đáng chú ý, việc ghi nhãn protein đã giảm đáng kể khi có natri azit hoặc trolox, được biết là có tác dụng dập tắt oxy đơn.Sự hiện diện của D2O, được biết là ổn định oxy đơn, giúp tăng cường tín hiệu ghi nhãn.Để điều tra sự đóng góp của các loại oxy phản ứng khác đối với việc ghi nhãn, mannitol và vitamin C đã được thêm vào để thiết lập các chất quét gốc hydroxyl và superoxide, tương ứng, 18, 29, nhưng chúng không làm giảm việc ghi nhãn.Bổ sung H2O2, nhưng không chiếu sáng, không dẫn đến ghi nhãn (Hình 3a bổ sung).Hình ảnh ôxy đơn ánh huỳnh quang với đầu dò Si-DMA đã xác nhận sự hiện diện của ôxy đơn trong dây HEK293T-miniSOG, nhưng không có trong dây HEK293T ban đầu.Ngoài ra, mitoSOX Red không thể phát hiện ra quá trình sản xuất superoxide sau khi chiếu sáng (Hình 1e và Hình 3b) 30. Những dữ liệu này gợi ý rõ ràng rằng oxy đơn là loại oxy phản ứng chính chịu trách nhiệm cho việc ghi nhãn proteomic sau đó.Độc tính tế bào của PDPL được đánh giá bao gồm chiếu xạ ánh sáng xanh và thăm dò hóa học, và không có độc tính tế bào đáng kể nào được quan sát thấy (Hình bổ sung 4a).
Để nghiên cứu cơ chế ghi nhãn và cho phép xác định proteomic của phức hợp protein bằng cách sử dụng LC-MS / MS, trước tiên chúng ta cần xác định axit amin nào bị biến đổi và khối lượng đồng bằng của nhãn mẫu dò.Methionine, histidine, tryptophan và tyrosine đã được báo cáo là bị biến đổi bởi oxy đơn 14,15.Chúng tôi tích hợp quy trình làm việc TOP-ABPP31 với tìm kiếm mở không thiên vị được cung cấp bởi nền tảng máy tính FragPipe dựa trên MSFragger32.Sau khi sửa đổi oxy đơn và ghi nhãn đầu dò hóa học, hóa học nhấp chuột được thực hiện bằng cách sử dụng nhãn khử biotin có chứa chất liên kết có thể phân tách, tiếp theo là kéo dài neutravidin và tiêu hóa trypsin.Peptide đã sửa đổi, vẫn còn liên kết với nhựa, được lưu quang để phân tích LC-MS / MS (Hình 2a và Dữ liệu Bổ sung 1).Một số lượng lớn các thay đổi xảy ra trong suốt proteome với hơn 50 kết quả phù hợp với bản đồ peptit (PSM) được liệt kê (Hình 2b).Đáng ngạc nhiên, chúng tôi chỉ quan sát thấy sự thay đổi histidine, có thể là do phản ứng của histidine bị oxy hóa đối với các đầu dò anilin cao hơn so với các axit amin khác.Theo cơ chế đã công bố của quá trình oxy hóa histidine bằng oxy đơn, 21,33 cấu trúc khối lượng delta được đề xuất của +229 Da tương ứng với chất cộng của mẫu dò 3 với 2-oxo-histidine sau hai lần oxy hóa, trong khi +247 Da là sản phẩm thủy phân của +229 Da (Hình bổ sung. 5).Việc đánh giá phổ MS2 cho thấy độ tin cậy cao trong việc xác định hầu hết các ion y và b, bao gồm cả việc xác định các ion phân mảnh đã biến đổi (y và b) (Hình 2c).Phân tích bối cảnh về trình tự cục bộ của các histidine được sửa đổi PDPL cho thấy sự ưa thích mô típ vừa phải đối với các gốc kỵ nước nhỏ ở vị trí ± 1 (Hình bổ sung 4b).Trung bình, 1,4 histidin được xác định trên mỗi protein, và vị trí của các dấu hiệu này được xác định bằng cách phân tích diện tích bề mặt có thể tiếp cận với dung môi (SASA) và khả năng cung cấp dung môi tương đối (RSA) (Hình bổ sung 4c, d).
Quy trình làm việc không thiên vị để nghiên cứu tính chọn lọc còn lại bằng cách sử dụng nền tảng tính toán FragPipe do MSFragger cung cấp.Các chất liên kết có thể phân tách được sử dụng trong hóa học Click để cho phép phân cắt quang của các peptit biến tính từ nhựa streptavidin.Một cuộc tìm kiếm mở đã được đưa ra để xác định nhiều sửa đổi, cũng như những phần còn lại có liên quan.b Chỉ định khối lượng các biến đổi xảy ra trong suốt proteome.Ánh xạ peptit PSM.c Chú thích phổ MS2 của các vị trí histidine được sửa đổi với đầu dò 3. Ví dụ đại diện, phản ứng cộng hóa trị với đầu dò 3 đã thêm +229.0938 Da vào axit amin đã sửa đổi.d Xét nghiệm đột biến được sử dụng để kiểm tra dấu hiệu PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) và PRDX1 (H10A, H81A, H169A) đã được truyền plasmid kiểu dại để phát hiện chống Flag.e Peptit tổng hợp được phản ứng với miniSOG tinh khiết khi có mặt của mẫu dò 3 và các sản phẩm tương ứng với Δm +247 và +229 được ghi nhận trong phổ LC-MS.f Tương tác giữa protein với protein trong ống nghiệm được mô hình hóa bằng thẻ miniSOG-6xHis và kháng thể kháng 6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) và phân tích Western blot chống chuột của phức hợp kháng thể miniSOG-6xHis / anti-6xHis được đánh dấu bằng đầu dò 3, tùy thuộc vào thời gian tiếp xúc với ánh sáng.Nhãn cho các protein riêng lẻ được thể hiện bằng trọng lượng phân tử tương ứng: chuỗi nhẹ kháng thể LC, chuỗi nặng kháng thể HC.Các thí nghiệm này được lặp lại độc lập ít nhất hai lần với kết quả tương tự.
Đối với xác minh sinh hóa của vị trí ghi nhãn, PRDX3 và PRDX1 được xác định bằng khối phổ đã được thay đổi từ histidine thành alanin và so với loại hoang dã trong các thử nghiệm chuyển nạp.Kết quả PDPL cho thấy sự đột biến làm giảm đáng kể việc ghi nhãn (Hình 2d).Trong khi đó, các trình tự peptit được xác định trong tìm kiếm mở được tổng hợp và phản ứng trong ống nghiệm với miniSOG tinh khiết với sự có mặt của đầu dò 3 và ánh sáng xanh lam, tạo ra các sản phẩm có sự dịch chuyển khối lượng +247 và +229 Da khi được LC-MS phát hiện (Hình . 2e).).Để kiểm tra xem các protein gần tương tác có thể được đánh dấu trong ống nghiệm để đáp ứng với quá trình quang hoạt miniSOG hay không, chúng tôi đã thiết kế một thử nghiệm lân cận nhân tạo bằng cách tương tác giữa protein miniSOG-6xHis và một kháng thể đơn dòng kháng His trong ống nghiệm (Hình 2f).Trong thử nghiệm này, chúng tôi mong đợi việc ghi nhãn gần của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể với miniSOG.Trên thực tế, thuốc chống chuột (nhận biết các chuỗi nặng và nhẹ của kháng thể đánh dấu 6xHis) và streptavidin Western blots cho thấy sự phân hủy sinh học mạnh mẽ của chuỗi nặng và nhẹ.Đáng chú ý, chúng tôi nhận thấy quá trình tự động oxy hóa miniSOG do thẻ 6xHis và các liên kết chéo giữa chuỗi nhẹ và chuỗi nặng, có thể liên quan đến khoảng cách được mô tả trước đây giữa phản ứng gần lysine và 2-oxo-histidine.Cuối cùng, chúng tôi kết luận rằng PDPL điều chỉnh histidine theo cách phụ thuộc gần nhau.
Mục tiêu tiếp theo của chúng tôi là xác định đặc điểm của proteome dưới tế bào để kiểm tra tính đặc hiệu của việc ghi nhãn tại chỗ.Do đó, chúng tôi biểu hiện ổn định miniSOG trong nhân, chất nền ty thể, hoặc màng ER bên ngoài của tế bào HEK293T (Hình 3a).Phân tích huỳnh quang gel cho thấy các dải được đánh dấu phong phú tại ba vị trí dưới tế bào cũng như các kiểu ghi nhãn khác nhau (Hình 3b).Phân tích hình ảnh huỳnh quang cho thấy độ đặc hiệu cao của PDPL (Hình 3c).Quy trình làm việc PDPL được theo sau bởi các phản ứng nhấp chuột với thuốc nhuộm rhodamine để xác định các proteome dưới tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang và các tín hiệu PDPL được định màu bằng DAPI, trình theo dõi ty thể hoặc trình theo dõi ER, xác nhận độ trung thực cao của PDPL.Đối với ba vị trí bào quan, so sánh song song của PDPL với TurboID bằng cách sử dụng avidin western blot cho thấy rằng PDPL được gắn nhãn cụ thể hơn so với các đối chứng tương ứng của chúng.Trong điều kiện PDPL, nhiều dải được gắn nhãn hơn xuất hiện, cho thấy nhiều protein được đánh dấu PDPL hơn (Hình bổ sung. 6a-d).
Biểu diễn giản đồ của ghi nhãn proteome đặc hiệu cho bào quan qua trung gian miniSOG.miniSOG nhắm mục tiêu chất nền ty thể thông qua sự dung hợp với 23 axit amin đầu N-của con người COX4 (mito-miniSOG), nhân thông qua sự dung hợp với H2B (nhân-miniSOG) và Sec61β qua phía tế bào chất của màng ER (ER-miniSOG ).Các chỉ định bao gồm hình ảnh gel, hình ảnh đồng tiêu và khối phổ.b Hình ảnh gel đại diện của ba cấu hình PDPL dành riêng cho bào quan.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Hình ảnh đồng tiêu đại diện của các tế bào HEK293T biểu hiện ổn định miniSOG với các vị trí dưới tế bào khác nhau được phát hiện bởi kháng thể đánh dấu V5 (màu đỏ).Dấu hiệu dưới tế bào được sử dụng cho ty thể và ER (màu xanh lá cây).Quy trình làm việc PDPL bao gồm việc phát hiện các proteomes tế bào dưới nhãn miniSOG (màu vàng) bằng cách sử dụng hóa học kích Cy3-azide.Thanh chia độ: 10 µm.d Đồ thị núi lửa của các proteome được gắn thẻ PDPL trong các bào quan khác nhau được định lượng bằng định lượng không gắn nhãn (n = 3 thí nghiệm sinh học độc lập).Phép thử t của Sinh viên hai đuôi được sử dụng trên các âm mưu núi lửa.Kiểu hoang dã HEK293T được sử dụng làm đối chứng âm. Các protein thay đổi đáng kể được tô màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch cường độ ion gấp 2 lần). Các protein thay đổi đáng kể được tô màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch cường độ ion gấp 2 lần). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интенсивности иности). Các protein bị thay đổi đáng kể được tô màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch 2 lần về cường độ ion).显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异）。显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （p <0,05 和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Các protein bị thay đổi đáng kể được đánh dấu bằng màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch 2 lần về cường độ ion).Các protein liên quan quan trọng đối với HEK293T-miniSOG nhưng không quan trọng đối với HEK293T được hiển thị bằng màu xanh lá cây.e Phân tích tính đặc hiệu của bộ dữ liệu proteomic từ các thí nghiệm d.Tổng số protein có ý nghĩa thống kê trong mỗi bào quan (chấm đỏ và xanh lá cây) được đánh dấu ở trên cùng.Biểu đồ cho thấy các protein khu trú trong các bào quan dựa trên phân tích MitoCarta 3.0, GO và A. Ting et al.Mọi người.Các bộ dữ liệu riêng biệt cho ty thể, hạt nhân và ER.Các thí nghiệm này được lặp lại độc lập ít nhất hai lần với kết quả tương tự.Dữ liệu thô được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Được khuyến khích bởi gel và kết quả hình ảnh, định lượng không nhãn được sử dụng để định lượng proteome đã được xác định trong mỗi bào quan (Dữ liệu bổ sung 2).HEK293T chưa được truyền đã được sử dụng làm điều khiển phủ định để trừ các điểm đánh dấu nền. Phân tích đồ thị núi lửa cho thấy các protein được làm giàu đáng kể (p <0,05 và> 2 lần cường độ ion) cũng như các protein đơn lẻ chỉ có trong các đường biểu hiện miniSOG (Hình. 3d chấm đỏ và xanh lục). Phân tích đồ thị núi lửa cho thấy các protein được làm giàu đáng kể (p <0,05 và> 2 lần cường độ ion) cũng như các protein đơn lẻ chỉ có trong các đường biểu hiện miniSOG (Hình. 3d chấm đỏ và xanh lục). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Phân tích đồ thị núi lửa cho thấy các protein được làm giàu đáng kể (p <0,05 và> 2 lần cường độ ion) cũng như các protein đơn lẻ chỉ có trong các đường biểu hiện miniSOG (Hình. 3d, các chấm màu đỏ và xanh lá cây).火山 图 分析 显示 出 显 着 富集 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅存 在于 miniSOG 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 和 绿色 点）。火山 图 分析 显示 出 显 着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 图 3d 红色 绿色 点 。。。））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Phân tích biểu đồ núi lửa cho thấy các protein được làm giàu đáng kể (p <0,05 và> 2x cường độ ion) cũng như các protein đơn lẻ chỉ có trong đường biểu hiện miniSOG (các chấm màu đỏ và xanh lá cây trong Hình 3d).Kết hợp những dữ liệu này, chúng tôi xác định được 1364, 461 và 911 protein màng ngoài nhân, ty thể và ER có ý nghĩa thống kê tương ứng.Để phân tích độ chính xác của PDPL bản địa hóa tổ chức, chúng tôi đã sử dụng MitoCarta 3.0, phân tích Gene Ontology (GO) và A. Ting et al.một bộ dữ liệu8 được sử dụng cho ti thể, nhân và ER để kiểm tra tính đặc hiệu của bào quan của các protein được phát hiện, tương ứng với độ chính xác 73,4, 78,5 và 73,0% (Hình 3e).Tính đặc hiệu của PDPL xác nhận rằng PDPL là một công cụ lý tưởng để xác định các proteome dành riêng cho bào quan.Đáng chú ý, phân tích trình sinh của các protein ty thể được xác định cho thấy rằng proteome bị mắc kẹt chủ yếu phân bố trong chất nền và màng trong (tương ứng là 226 và 106), chiếm 91,7% (362) tổng số protein ty thể được xác định.một mức độ cao của PDPL đã được xác nhận bổ sung (Hình bổ sung. 7a).Tương tự, phân tích dưới hạt nhân cho thấy rằng proteome bị bắt được phân bố chủ yếu trong nhân, hạt nhân và hạt nhân (Hình 7b bổ sung).Phân tích protein hạt nhân với peptit tín hiệu bản địa hóa hạt nhân (3xNLS) cho thấy độ chính xác tương tự với cấu trúc H2B (Hình bổ sung. 7c – h).Để xác định tính đặc hiệu của điểm đánh dấu PDPL, laminin hạt nhân A được chọn làm bẫy POI7 bản địa hóa riêng biệt hơn.PDPL đã xác định được 36 protein được làm giàu đáng kể, trong đó 12 protein (30,0% bao gồm lamin A) là các protein tương tác lamin A có đặc điểm tốt được chú thích bởi cơ sở dữ liệu String, với tỷ lệ phần trăm cao hơn so với phương pháp BioID (122 protein) 28 trên 28,22,9 %) 7. Phương pháp của chúng tôi xác định được ít protein hơn, có thể do các khu vực ghi nhãn hạn chế, điều này được thực hiện nhờ oxy đơn hoạt tính hơn.Phân tích GO cho thấy rằng các protein được xác định chủ yếu nằm trong nhân chất (26), màng nhân (10), màng nhân (9) và lỗ nhân (5).Nói chung, các protein khu trú ở nhân này chiếm 80% các protein được làm giàu, chứng tỏ thêm tính đặc hiệu của PDPL (Hình bổ sung 8a – d).
Sau khi thiết lập khả năng của PDPL để thực hiện đánh dấu vùng lân cận trong các bào quan, sau đó chúng tôi kiểm tra xem liệu PDPL có thể được sử dụng để phân tích các đối tác liên kết POI hay không.Đặc biệt, chúng tôi đã tìm cách xác định phân tích PDPL của các protein tế bào, được coi là mục tiêu khó hơn so với các đối tác cục bộ màng của chúng do bản chất năng động cao của chúng.Bromodomain và protein ngoài tinh thể (BET) BRD4 đã thu hút sự chú ý của chúng tôi vì vai trò quan trọng của nó đối với các bệnh khác nhau 35, 36.Phức hợp được tạo thành bởi BRD4 là một chất đông hóa phiên mã và là một mục tiêu điều trị quan trọng.Bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của các yếu tố phiên mã c-myc và Wnt5a, BRD4 được cho là yếu tố quyết định chính của bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (AML), đa u tủy, ung thư hạch Burkitt, ung thư ruột kết và các bệnh viêm nhiễm.Ngoài ra, một số vi rút nhắm vào BRD4 để điều chỉnh sự phiên mã của vi rút và tế bào, chẳng hạn như vi rút papillomavirus, HIV và SARS-CoV-236,39.
Để lập bản đồ tương tác BRD4 bằng cách sử dụng PDPL, chúng tôi đã kết hợp miniSOG với dạng đồng dạng đầu cuối N hoặc C ngắn của BRD4.Các kết quả về proteomic cho thấy mức độ chồng chéo cao giữa hai cấu trúc (Hình bổ sung. 9a).Proteome hạt nhân được xác định bằng miniSOG-H2B bao gồm 77,6% protein tương tác với BRD4 (Hình 9b bổ sung).Sau đó, các thời điểm chiếu sáng khác nhau (2, 5, 10, 20 phút) được sử dụng để điều chỉnh bán kính điểm đánh dấu (Hình 4a và dữ liệu bổ sung 3).Chúng tôi kết luận rằng ở các chu kỳ quang ngắn hơn, PDPL chủ yếu sẽ gắn nhãn các đối tác liên kết trực tiếp, trong khi thời gian dài hơn sẽ bao gồm các protein được xác định trong thời gian quang hoạt ngắn hơn cũng như các mục tiêu gián tiếp trong các phức hợp ghi nhãn.Trên thực tế, chúng tôi nhận thấy sự chồng chéo mạnh mẽ giữa các điểm thời gian liền kề (84,6% trong 2 và 5 phút; 87,7% trong 5 và 10 phút; 98,7% trong 10 và 20 phút) (Hình 4b và Hình 9c bổ sung).Trong tất cả các nhóm thử nghiệm, chúng tôi không chỉ tìm thấy tự gắn nhãn BRD4 mà còn một số mục tiêu đã biết như MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A và HMGB1 được chú thích trong cơ sở dữ liệu chuỗi.Cường độ ion của các mục tiêu này tỷ lệ thuận với thời gian tiếp xúc (Hình 4c và Hình 9d bổ sung).Phân tích GO của các protein được xác định trong nhóm kéo dài 2 phút cho thấy rằng các protein được xác định nằm trong nhân và tham gia vào chức năng tái cấu trúc nhiễm sắc và RNA polymerase.Chức năng phân tử của protein được làm giàu trong liên kết nhiễm sắc hoặc kích hoạt phiên mã, phù hợp với chức năng BRD4 (Hình 4d).Phân tích tương tác protein hỗ trợ cơ sở dữ liệu chuỗi cho thấy mức độ tương tác gián tiếp đầu tiên giữa các phức hợp tương tác họ BRD4 và HDAC như SIN3A, NCOR2, BCOR và SAP130 (Hình 4e và Hình bổ sung 9e), phù hợp với các histone acetyl hóa liên kết BRD4 và HDAC ..Ngoài ra, các mục tiêu đại diện được xác định bởi LC-MS / MS, bao gồm Sin3A, NSUN2, Fus và SFPQ, đã được xác nhận bởi Western blotting (Hình 4f).Gần đây, đồng dạng ngắn của BRD4 đã được báo cáo là hình thành hạt nhân với đặc tính phân tách pha lỏng-lỏng (LLPS).Các protein liên kết RNA Fus và SFPQ làm trung gian cho LLPS của các quá trình tế bào khác nhau và được xác định ở đây là các protein liên kết BRD4 không được ghi lại.Sự tương tác giữa BRD4 và SFPQ đã được xác nhận bằng các thí nghiệm đồng kết tủa miễn dịch (co-IP) (Hình 4g), cho thấy một cơ chế khác để phân tách pha lỏng-lỏng qua trung gian BRD4 cần được nghiên cứu thêm.Tổng hợp lại, những kết quả này cho thấy rằng PDPL là một nền tảng lý tưởng để xác định các protein tương tác BRD4 đã biết cũng như các protein liên kết chưa biết.
a Biểu diễn giản đồ của đánh dấu độ gần BRD4 qua trung gian miniSOG, thời gian phơi sáng: 2, 5, 10 và 20 phút.b Sự chồng chéo của các protein được xác định ở các thời điểm chiếu sáng khác nhau.Sự làm giàu protein được xác định trong HEK293T-miniSOG-BRD4 có ý nghĩa thống kê so với HEK293T kiểu hoang dã.c Cường độ ion khi định lượng các protein liên kết BRD4 đã biết đại diện không được gắn nhãn trong thời gian phơi nhiễm quy định.n = 3 mẫu độc lập về mặt sinh học.Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn.d Phân tích bản thể học gen (GO) của các protein được xác định trong nhóm 2 phút.Mười điều khoản GO đầu tiên được liệt kê.Bong bóng được tô màu theo danh mục thuật ngữ GO và kích thước bong bóng tỷ lệ với số lượng protein được tìm thấy trong mỗi thuật ngữ.e Phân tích chuỗi các protein tương tác với BRD4.Các vòng tròn màu vàng là lớp keo trực tiếp và các vòng tròn màu xám là lớp keo gián tiếp đầu tiên.Các đường màu đỏ đại diện cho các tương tác được xác định bằng thực nghiệm và các đường màu xanh lam đại diện cho các tương tác được dự đoán.f Các mục tiêu ràng buộc BRD4 đại diện được xác định trong LC-MS / MS đã được xác minh bằng phương pháp Western blotting.g Các thí nghiệm đồng kết tủa miễn dịch xác nhận sự tương tác giữa SFPQ và BRD4.Các thí nghiệm này được lặp lại độc lập ít nhất hai lần với kết quả tương tự.Dữ liệu thô được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Ngoài việc xác định các mục tiêu liên quan đến POI chưa đăng ký, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng PDPL sẽ phù hợp để xác định các cơ chất cho các enzym, điều này sẽ yêu cầu xác định đặc tính của các protein liên kết gián tiếp trong các phức hợp lớn để chú thích các cơ chất chưa được đăng ký.Parkin (được mã hóa bởi PARK2) là một ligase E3 và các đột biến trong parkin được biết là nguyên nhân gây ra bệnh Parkinson ở trẻ vị thành niên lặn trên NST thường (AR-JP) 42.Ngoài ra, parkin đã được mô tả là cần thiết cho quá trình ty thể (mitochondrial autophagy) và loại bỏ các loại oxy phản ứng.Tuy nhiên, mặc dù một số cơ chất của parkin đã được xác định, vai trò của parkin trong bệnh này vẫn chưa rõ ràng.Để chú thích các chất nền không được xác định của nó, PDPL đã được thử nghiệm bằng cách thêm miniSOG vào đầu cuối N- hoặc C của parkin.Các tế bào được xử lý bằng chất vận chuyển proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) để kích hoạt parkin thông qua con đường PINK1-Parkin.So với kết quả PDPL BRD4 của chúng tôi, sự hợp nhất parkin N-endinus tiết lộ một tập hợp lớn hơn các protein mục tiêu, mặc dù nó bao phủ một phần lớn hơn của C-endinus (177 trên 210) (Hình 5a, b và Dữ liệu bổ sung 4).kết quả phù hợp với các báo cáo rằng thẻ đầu cuối N có thể kích hoạt sai Parkin44.Đáng ngạc nhiên, chỉ có 18 protein chồng chéo trong dữ liệu của chúng tôi với kết quả AP-MS được công bố cho Parkin43, có thể là do sự khác biệt giữa các dòng tế bào và quy trình làm việc của proteomics.Ngoài bốn protein đã biết (ARDM1, HSPA8, PSMD14 và PSMC3) được xác định bằng hai phương pháp (Hình 5c) 43.Để xác nhận thêm kết quả của LC-MS / MS, điều trị PDPL và phương pháp thấm Western tiếp theo được sử dụng để so sánh kết quả của xét nghiệm tế bào mẹ HEK293T và dòng parkin đầu cuối N ổn định.Các mục tiêu chưa biết trước đây CDK2, DUT, CTBP1 và PSMC4 đã được kiểm tra với chất kết dính đã biết, DNAJB1 (Hình 5d).
Biểu đồ núi lửa của các protein tương tác với parkin trong các tế bào HEK293T có miniSOG được biểu hiện ổn định đã hợp nhất với đầu tận cùng N hoặc C của parkin (n = 3 thí nghiệm sinh học độc lập).Phép thử t của Sinh viên hai đuôi được sử dụng trên các âm mưu núi lửa.HEK293T được sử dụng như một đối chứng tiêu cực. Các protein thay đổi đáng kể được tô màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch cường độ ion gấp 2 lần). Các protein thay đổi đáng kể được tô màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch cường độ ion gấp 2 lần). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интенсивности иности). Các protein bị thay đổi đáng kể được tô màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch 2 lần về cường độ ion).显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异）。显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （p <0,05 和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Các protein bị thay đổi đáng kể được đánh dấu bằng màu đỏ (p <0,05 và> chênh lệch 2 lần về cường độ ion).Các protein liên quan quan trọng đối với HEK293T-miniSOG nhưng không quan trọng đối với HEK293T được hiển thị bằng màu xanh lá cây.b Biểu đồ Venn cho thấy các protein chồng chéo giữa cấu trúc đầu N và đầu C.Các thẻ N-terminal có thể kích hoạt parkin một cách khác thường và dẫn đến các protein dễ nhận biết hơn.c Biểu đồ Venn cho thấy các protein chồng chéo giữa PDPL và AP-MS.Các chất tương tác đã biết được liệt kê, bao gồm 4 trong số 18 protein chồng chéo và 11 trong số 159 protein được xác định cụ thể trong PDPL.d Các mục tiêu đại diện được xác định bởi LC-MS / MS đã được xác minh bởi Western blotting.e Ssu72 và SNW1 được xác định là chất nền parkin chưa đăng ký.Các plasmid protein được gắn thẻ FLAG này được chuyển thành HEK293T và HEK293T-Parkin-miniSOG sau đó được xử lý bằng CCCP tại các thời điểm khác nhau.Sự suy thoái rõ ràng hơn ở đường biểu hiện quá mức của Parkin.f Sử dụng chất ức chế proteasome MG132, người ta đã xác nhận rằng quá trình phân hủy của Ssu72 và SNW1 được thực hiện qua trung gian của phản ứng proteasome-ubiquitination.Các thí nghiệm này được lặp lại độc lập ít nhất hai lần với kết quả tương tự.Dữ liệu thô được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Đáng chú ý, các protein được xác định bởi PDPL phải bao gồm các protein liên kết parkin và chất nền của chúng.Để phát hiện các chất nền parkin chưa được đăng ký, chúng tôi đã chọn bảy protein đã được xác định (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 và SNW1) và các plasmid đã chuyển nhiễm để các gen này tiếp xúc với HEK293T bình thường và biểu hiện ổn định HEK293T của miniSOG-Parkin, sau đó là xử lý CCCP.Mức độ của các protein Ssu72 và SNW1 đã giảm đáng kể trong dòng miniSOG-Parkin ổn định (Hình 5e).Xử lý bằng CCCP trong 12 giờ dẫn đến sự xuống cấp đáng kể nhất của cả hai chất nền.Để điều tra xem liệu sự phân hủy của Ssu72 và SNW1 có được điều chỉnh bởi quá trình proteasome-ubiquitination hay không, chất ức chế proteasome MG132 đã được thêm vào để ức chế hoạt động của proteasome và trên thực tế, chúng tôi thấy rằng quá trình phân hủy của chúng đã bị ức chế (Hình 5f).Các mục tiêu không phải chất nền bổ sung đã được xác nhận là chất tương tác Parkin bằng cách sử dụng phương pháp thấm Western (Hình bổ sung 10), cho kết quả phù hợp với LC-MS / MS.Tóm lại, việc tích hợp quy trình PDPL với xác minh chuyển nạp protein đích cho phép xác định các chất nền ligase E3 chưa đăng ký.
Chúng tôi đã phát triển một nền tảng đánh dấu vùng lân cận chung cho phép bạn xác định các POI tương tác trong không gian và thời gian.Nền tảng này dựa trên protein miniSOG photosensitizer, chỉ có kích thước khoảng 12 kDa, nhỏ hơn một nửa kích thước của enzyme APEX2 trưởng thành (27 kDa) và một phần ba kích thước của TurboID (35 kDa).Kích thước nhỏ hơn sẽ mở rộng đáng kể phạm vi ứng dụng để nghiên cứu các tương tác protein nhỏ.Cần khám phá thêm các chất cảm quang bổ sung, cho dù là các protein được mã hóa di truyền hay các phân tử nhỏ, để tăng năng suất lượng tử của oxy đơn và mở rộng độ nhạy của phương pháp này.Đối với phiên bản miniSOG hiện tại, có thể đạt được độ phân giải theo thời gian cao bằng cách sử dụng ánh sáng xanh lam để kích hoạt các điểm đánh dấu khoảng cách.Ngoài ra, thời gian tiếp xúc lâu hơn giải phóng một “đám mây” oxy đơn lớn hơn, dẫn đến sửa đổi các dư lượng histidine ở xa hơn, tăng bán kính ghi nhãn và khả năng tinh chỉnh độ phân giải không gian PDPL.Chúng tôi cũng đã thử nghiệm bảy đầu dò hóa học để tăng tỷ lệ tín hiệu trên nền và khám phá cơ chế phân tử đằng sau cách tiếp cận này.Quy trình làm việc TOP-ABPP kết hợp với tìm kiếm mở không thiên vị đã xác nhận rằng các sửa đổi chỉ xảy ra trong histidine và không có môi trường vi mô nhất quán nào được quan sát để tăng các sửa đổi histidine, ngoại trừ sự ưu tiên vừa phải đối với histidine trong vùng mạch vòng.
PDPL cũng đã được sử dụng để mô tả các proteome dưới tế bào với tính đặc hiệu và độ bao phủ của proteome ít nhất có thể so sánh với các phương pháp ghi nhãn vùng lân cận và các phương pháp thăm dò hóa học cụ thể cho bào quan khác.Các dấu hiệu lân cận cũng đã được sử dụng thành công để xác định đặc điểm của bề mặt, lysosome và các proteome liên kết với quần thể bí mật46,47.Chúng tôi tin rằng PDPL sẽ tương thích với các bào quan dưới tế bào này.Ngoài ra, chúng tôi đã thách thức PDPL bằng cách xác định các mục tiêu liên kết protein tế bào phức tạp hơn các protein liên kết màng do đặc tính động của chúng và tham gia vào nhiều tương tác thời gian hơn.PDPL được áp dụng cho hai protein, chất coactivator phiên mã BRD4 và ligase E3 Parkin liên quan đến bệnh.Hai loại protein này được chọn không chỉ vì các chức năng sinh học cơ bản của chúng mà còn vì sự liên quan đến lâm sàng và tiềm năng điều trị của chúng.Đối với hai POI này, các đối tác ràng buộc nổi tiếng cũng như các mục tiêu chưa đăng ký đã được xác định.Đáng chú ý, protein SFPQ liên quan đến sự phân tách pha đã được xác nhận bởi co-IP, điều này có thể chỉ ra một cơ chế mới mà BRD4 (đồng dạng ngắn) điều chỉnh LLPS.Đồng thời, chúng tôi tin rằng việc xác định chất nền Parkin là một kịch bản trong đó việc xác định chất kết dính gián tiếp là bắt buộc.Chúng tôi đã xác định hai chất nền parkin không xác định và xác nhận sự suy thoái của chúng theo con đường phổ biến-proteasome.Gần đây, một chiến lược bẫy dựa trên cơ chế đã được phát triển để phát hiện các cơ chất hydrolase bằng cách bẫy chúng bằng các enzym.Mặc dù đây là một phương pháp rất mạnh, nhưng nó không thích hợp để phân tích các cơ chất tham gia vào việc hình thành các phức chất lớn và đòi hỏi sự hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa enzym và cơ chất.Chúng tôi kỳ vọng rằng PDPL có thể được mở rộng để nghiên cứu các phức hợp protein và họ enzyme khác, chẳng hạn như họ deubiquitinase và metalloprotease.
Một dạng miniSOG mới, được gọi là SOPP3, đã được phát triển với khả năng sản xuất oxy đơn lẻ được cải thiện.Chúng tôi so sánh miniSOG với SOPP3 và nhận thấy hiệu suất đánh dấu được cải thiện, mặc dù tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu vẫn không thay đổi (Hình bổ sung. 11).Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc tối ưu hóa SOPP3 (ví dụ: thông qua quá trình tiến hóa có định hướng) sẽ dẫn đến các protein cảm quang hiệu quả hơn, đòi hỏi thời gian ánh sáng ngắn hơn và do đó cho phép bắt các quá trình tế bào năng động hơn.Đáng chú ý, phiên bản hiện tại của PDPL bị giới hạn trong môi trường tế bào vì nó yêu cầu chiếu sáng bằng ánh sáng xanh và không thể xuyên qua các mô sâu.Tính năng này ngăn cản việc sử dụng nó trong các nghiên cứu mô hình động vật.Tuy nhiên, sự kết hợp giữa di truyền quang học với PDPL có thể tạo cơ hội cho nghiên cứu trên động vật, đặc biệt là trong não.Ngoài ra, các chất cảm quang hồng ngoại được chế tạo khác cũng loại bỏ hạn chế này.Nghiên cứu hiện đang được tiến hành trong lĩnh vực này.
Dòng tế bào HEK293T được lấy từ ATCC (CRL-3216).Dòng tế bào được xét nghiệm âm tính với nhiễm mycoplasma và được nuôi cấy trong DMEM (Thermo, # C11995500BT) bổ sung 10% huyết thanh bò thai (FBS, Vistech, # SE100-B) và 1% penicillin / streptomycin (Hyclone, # SV30010).trồng ở.
3-Aminophenylene (mẫu 3) và (4-ethynylphenyl) methanamine (mẫu 4) đã được mua từ Bidepharm.Propylamine (đầu dò 2) được mua từ Energy-Chemicals.N- (2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (mẫu dò 1) được tổng hợp theo các phương pháp đã được công bố.
Bảng bổ sung 1 liệt kê các cấu trúc di truyền được sử dụng trong nghiên cứu này.Trình tự miniSOG và KillerRed được nhân bản từ một plasmid quà tặng từ P. Zou (Đại học Bắc Kinh).Trình tự nhắm mục tiêu ma trận ty thể được bắt nguồn từ 23 axit amin đầu N của COX4 và được nhân bản vào các vectơ được chỉ định bằng cách sử dụng tập hợp Gibson (Beyotime, # D7010S).Để nhắm mục tiêu màng và nhân của lưới nội chất, DNA người SEC61B (NM_006808.3) (NEB, # M0491L) được khuếch đại bằng PCR từ thư viện cDNA của tế bào HEK293T và DNA H2B (do D. Lin, Phòng thí nghiệm Vịnh Thâm Quyến tặng) và nhân bản, như đã đề cập ở trên.Trừ khi có chỉ định khác, các gen protein khác được sử dụng để chuyển nạp và xây dựng các dòng tế bào ổn định được PCR khuếch đại từ thư viện cDNA tế bào HEK293T.G3S (GGGS) và G4S (GGGGS) được sử dụng làm chất liên kết giữa protein mồi và miniSOG.Một thẻ epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) đã được thêm vào các cấu trúc hợp nhất này.Để biểu hiện ở động vật có vú và để thiết lập một dòng tế bào ổn định, cấu trúc dung hợp miniSOG đã được phụ dòng vào vectơ phân tử pLX304.Đối với sự biểu hiện của vi khuẩn, miniSOG đã được nhân bản vào vectơ pET21a có nhãn 6xHis ở đầu cuối C.
Tế bào HEK293T được tạo giống ở 2,0 x 105 tế bào mỗi giếng trong đĩa sáu giếng và được truyền 24 giờ sau đó với plasmid nội siêu vi tái tổ hợp (2,4 μg pLX304) và plasmid đóng gói virus (1,5 μg psPAX2 và 1,2 μg pMD2.G) bằng cách sử dụng Lipo8000 (Beyotime , # C0533), khoảng 80% hợp nhất.Sau khi chuyển qua đêm, môi trường được thay đổi và ủ thêm 24 giờ.Việc thu thập vi rút được thực hiện sau 24, 48 và 72 giờ.Trước khi lây nhiễm các dòng tế bào đích, môi trường virus đã được lọc qua bộ lọc 0,8 μm (Merck, # millex-GP) và polybrene (Solarbio, # H8761) được thêm vào với nồng độ 8 μg / ml.Sau 24 giờ, các tế bào được phép phục hồi bằng cách thay đổi môi trường.Các tế bào được chọn bằng cách sử dụng 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, # 3513-03-9) cho ba đoạn đầu tiên như một lựa chọn nghiêm ngặt hơn.Sau đó, sử dụng 20 μg / ml như một chế độ nghiêm ngặt hơn cho ba giai đoạn tiếp theo.
Tế bào được gieo hạt trong các buồng 12 giếng (Ibidi, # 81201) với mật độ khoảng 20.000 tế bào mỗi giếng.Để cải thiện độ bám dính của tế bào HEK293T, thêm 50 µg / ml fibronectin (Corning, # 356008) pha loãng trong nước muối đệm phosphat (PBS, Sangon, # B640435) ở 37 ° C.Các khoang được xử lý trước trong 1 giờ và sau đó được loại bỏ bằng PBS.Sau 24 giờ, các tế bào được rửa một lần bằng PBS, ủ với đầu dò 1 mM 3 trong dung dịch muối cân bằng mới của Hanks (HBSS, Gibco, # 14025092) trong 1 giờ ở 37 ° C, và sau đó được ủ với đèn LED màu xanh lam (460 nm ).) được chiếu xạ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và cố định bằng 4% formaldehyde trong PBS (Sangon, # E672002) trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.Formaldehyde dư thừa đã được loại bỏ khỏi các ô cố định bằng cách rửa ba lần với PBS.Sau đó, các tế bào được làm thấm với 0,5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) trong PBS và rửa 3 lần bằng PBS.Sau đó, tháo khoang và thêm vào mỗi mẫu 25 µl hỗn hợp phản ứng nhấp có chứa 50 µM Cy3-azide (Aladdin, # C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, # A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, # BDJ-4) và 0,5 mg / ml natri ascorbate (Aladdin, số S105024) và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.Sau phản ứng nhanh, các tế bào được rửa sáu lần bằng PBS chứa 0,05% Tween-20 (Sangon, # A600560) (PBST) và sau đó được chặn bằng 5% BSA (Abcone, # B24726) trong PBST trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Đối với phương pháp nhuộm miễn dịch tạo màu, các tế bào được ủ với các kháng thể chính theo các điều kiện được chỉ định: mAb thẻ kháng V5 của chuột (1: 500, CST, # 80076), thỏ kháng Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, # A0564), kháng thể đa dòng kháng calnexin của thỏ (1: 500, Abcam, # ab22595) hoặc kháng thể đơn dòng kháng lamin A / C của thỏ (1: 500; CST, # 2032) ở 4 ° C qua đêm.Sau khi rửa 3 lần bằng PBST, các tế bào được ủ với các kháng thể thứ cấp: dê chống thỏ Alexa Fluor 488 (Thermo, # A11034) pha loãng 1: 1000, dê chống chuột Alexa Fluor 594 (CST, # 8889) pha loãng 1: 1000.pha loãng Pha loãng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.Sau đó, các tế bào được rửa 3 lần bằng PBST và chống lại bằng DAPI (Thermo, # D1306) trong PBS trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.Sau 3 lần rửa bằng PBS, các tế bào được niêm phong trong 50% glycerol (Sangon, # A600232) trong PBS để tạo ảnh.Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang thu được bằng kính hiển vi tiêu điểm ZEISS LSM 900 Airyscan2 và phần mềm ZNE 3.5.
Đối với hình ảnh huỳnh quang oxy đơn, các tế bào được rửa hai lần với đệm Hanks HEPES trước khi thêm 100 nM Si-DMA trong đệm Hanks HEPES (DOJINDO, # MT05).Sau khi tiếp xúc với ánh sáng, các tế bào được ủ trong tủ ấm CO2 ở 37 ° C trong 45 phút.Sau đó, các tế bào được rửa hai lần với đệm HEPES của Hanks và chống lại bằng đệm HEPES của Hoechst trong Hanks trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và được quan sát bằng kính hiển vi đồng tiêu ZEISS LSM 900., # M36008) trong bộ đệm HBSS có chứa canxi và magiê.Sau khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc doxorubicin (MCE, # HY-15142A), các tế bào được ủ trong tủ ấm CO2 ở 37 ° C. trong 10 phút, rửa hai lần bằng đệm HBSS và ủ với Hoechst trong đệm HBSS ở nhiệt độ phòng.phút.Doxorubicin được sử dụng như một chất kiểm soát thăm dò tích cực trong đó các tế bào được xử lý bằng 20 μM doxorubicin trong HBSS chứa 1% BSA trong 30 phút.Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang thu được bằng kính hiển vi tiêu điểm Zeiss LSM 900.
Tế bào HEK293T biểu hiện ổn định mito-miniSOG được gieo hạt với mật độ xấp xỉ 30% trong đĩa 15 cm.Sau 48 giờ, khi đạt đến độ hợp lưu ~ 80%, các tế bào được rửa một lần bằng PBS, ủ với 1 mM Probe 3 trong dung dịch đệm HBSS mới trong 1 giờ ở 37 ° C và sau đó được chiếu sáng bằng đèn LED màu xanh lam trong 10 phút trong phòng. nhiệt độ..Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS, cạo và ngâm lại trong đệm PBS lạnh đá có chứa chất ức chế protease không EDTA (MCE, # HY-K0011).Các tế bào được ly giải bằng cách tạo âm đầu nhọn trong 1 phút (1 giây bật và 1 giây tắt ở biên độ 35%).Hỗn hợp thu được được ly tâm ở 15,871 xg trong 10 phút ở 4 ° C để loại bỏ các mảnh vụn, và nồng độ phần nổi phía trên được điều chỉnh thành 4 mg / mL bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein BCA (Beyotime, # P0009).Kết hợp 1 ml dịch lysate ở trên với 0,1 mM biotin azide có thể phân hủy quang (Confluore, # BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, # A600974), 0,1 mM phối tử TBTA (Aladdin, # T162437) và tủ ấm 1 mM CuSO4 có đáy quay lên trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.Sau khi phản ứng xảy ra nhanh, cho hỗn hợp vào dung dịch đã trộn trước (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) trong lọ thủy tinh 10 ml.Các mẫu được trộn và ly tâm ở 4500 g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.Các dung dịch dưới và trên được loại bỏ, kết tủa được rửa hai lần bằng 1 ml metanol và ly tâm ở 15871 × g trong 5 phút ở 4 ° C.Thêm 1 ml urê 8 M (Aladdin, no. U111902) trong 25 mM amoni bicacbonat (ABC, Aladdin, no. A110539) để hòa tan kết tủa.Các mẫu được hoàn nguyên với 10 mM dithiothreitol (Sangon, # A100281 trong 25 mM ABC) trong 40 phút ở 55 ° C, sau đó bổ sung 15 mM iodoacetamide tươi (Sangon, # A600539) ở nhiệt độ phòng trong bóng tối.Alkyl hóa trong vòng 30 phút..Thêm 5 mM dithiothreitol để dừng phản ứng.Chuẩn bị khoảng 100 µl hạt NeutrAvidin agarose (Thermo, # 29202) cho mỗi mẫu bằng cách rửa 3 lần với 1 ml PBS.Dung dịch proteome trên được pha loãng với 5 ml PBS và ủ với hạt NeutrAvidin agarose đã rửa trước trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng.Sau đó, các hạt được rửa 3 lần với 5 ml PBS chứa 0,2% SDS (Sangon, # A600485), 3 lần với 5 ml PBS chứa 1M urê, và 3 lần với 5 ml ddH2O.Sau đó, các hạt được thu hoạch bằng cách ly tâm và được tiếp tục trong 200 μl 25 mM ABC chứa 1 M urê, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) và 20 ng / μl trypsin (Promega, # V5280).Thử quay vòng qua đêm ở 37 ° C.Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm axit formic (Thermo, # A117-50) cho đến khi pH đạt 2-3.Hạt được rửa 3 lần với 1 ml PBS chứa 0,2% SDS, 3 lần với 1 ml PBS chứa urê 1 M, và sau đó 3 lần với 1 ml nước cất.Các peptit biến tính được giải phóng bằng cách ly giải ánh sáng (365 nm) trong 90 phút sử dụng 200 μl MeOH 70%.Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được thu thập.Sau đó, các hạt được rửa một lần với 100 μl MeOH 70% và phần nổi phía trên được gộp lại.Mẫu được làm khô trong máy cô đặc chân không Speedvac và được bảo quản ở -20 ° C cho đến khi phân tích.
Để xác định và định lượng peptit biến tính oxy đơn lẻ, các mẫu được hòa tan lại trong 0,1% axit formic và 1 μg peptit được phân tích bằng máy khối phổ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid được trang bị nguồn ESI nano từ Tune và Xcalibur từ phần mềm của nhà cung cấp 4.3.Các mẫu được phân tách trên cột mao quản 75 µm × 15 cm được đóng gói bên trong bằng vật liệu C18 3 µm (ReproSil-pur, # r13.b9.) Và được kết nối với hệ thống EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Các peptit được tách bằng sắc ký gradient tuyến tính 95 phút từ 8% dung môi B đến 50% dung môi B (A = 0,1% axit fomic trong nước, B = 0,1% axit fomic trong 80% axetonitril), sau đó tăng tuyến tính lên 98% B phút trong 6 phút với tốc độ dòng chảy 300 nl / phút.Orbitrap Fusion Lumos thu thập dữ liệu xen kẽ giữa quét toàn bộ MS và quét MS2 tùy thuộc vào dữ liệu.Điện áp phún xạ được đặt thành 2,1 kV và nhiệt độ của mao quản vận chuyển ion là 320 ° C.Phổ MS (350-2000 m / z) được thu thập với độ phân giải 120.000, AGC 4 × 105 và thời gian đầu vào tối đa là 150 ms.10 tiền chất tích điện đa cực phổ biến nhất trong mỗi lần quét đầy đủ được phân mảnh bằng HCD với năng lượng va chạm chuẩn hóa là 30%, cửa sổ cách ly tứ cực là 1,6 m / z và cài đặt độ phân giải là 30.000.Mục tiêu AGC cho phép đo khối phổ song song sử dụng 5 × 104 và thời gian đầu vào tối đa 150 ms.Ngoại lệ động được đặt thành 30 giây. Các ion không được chỉ định hoặc những ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS. Các ion không được chỉ định hoặc những ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. Các ion không được chỉ định hoặc các ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS.未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. Các ion không xác định hoặc các ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS.
Dữ liệu thô được xử lý bằng nền tảng tính toán FragPipe dựa trên MSFragger.Độ chệch khối lượng và các axit amin tương ứng được xác định bằng cách sử dụng thuật toán tìm kiếm mở với dung sai khối lượng tiền thân từ -150 đến 500 Da.Các peptit biến tính sau đó được xác định bằng cách sử dụng các sửa đổi histidine với mức tăng khối lượng là +229.0964 và +247.1069 Da trong PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Các tế bào biểu hiện ổn định gen miniSOG hợp nhất được mạ trong các đĩa dài 6 cm.Khi đạt đến độ hợp lưu ~ 80%, các tế bào được rửa một lần bằng HBSS (Gibco, # 14025092), sau đó được ủ với đầu dò hóa học trong HBSS trong 1 giờ ở 37 ° C và được chiếu sáng bằng ánh sáng xanh.Đèn LED 10W trong 20 phút ở nhiệt độ phòng.Để xác định loại oxy phản ứng nào có liên quan đến PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, # HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, # HY-101445), D2O (Sigma, # 7789-20-0), 100 mM mannitol (Hóa chất Năng lượng, # 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 được thêm vào tế bào dưới dạng chất bổ sung.Sau khi rửa bằng PBS lạnh, tế bào được cạo, thu thập trong ống ly tâm 1,5 ml, và được ngâm với một đầu hút trong 1 phút trong 200 μl PBS với 1x chất ức chế protease không có EDTA (1 giây và 1 giây không có, biên độ 35%).Hỗn hợp thu được được ly tâm ở 15,871 × g trong 10 phút ở 4 ° C và nồng độ phần nổi phía trên được điều chỉnh thành 1 mg / mL bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein BCA.Khoảng 50 µl dịch ly trên được ủ với 0,1 mM rhodamine azide (Aladdin, số T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM phối tử TBTA, và 1 mM CuSO4 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với chuyển động quay từ dưới lên trên.Sau phản ứng nhấp nháy, kết tủa với axeton được thực hiện bằng cách thêm 250 μl axeton đã được làm lạnh trước vào mẫu, ủ ở -20 ° C trong 20 phút và ly tâm ở 6010 × g trong 10 phút ở 4 ° C.Thu viên và đun sôi trong 50 µl dung dịch đệm Laemmli 1x trong 10 phút ở 95 ° C.Sau đó, các mẫu được phân tích trên gel dài SDS-PAGE và được hiển thị trực quan bằng cách sử dụng hệ thống hình ảnh Bio-rad ChemiDoc MP Touch với phần mềm Image Lab Touch.
Sự biểu hiện và tinh sạch của protein miniSOG-6xHis tái tổ hợp đã được thực hiện như đã mô tả trước đây.Một cách ngắn gọn, tế bào E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) được biến nạp với pET21a-miniSOG-6xHis và biểu hiện protein được cảm ứng với 0,5 mM IPTG (Sangon, # A600168).Sau khi ly giải tế bào, protein được tinh chế bằng cách sử dụng hạt agarose Ni-NTA (MCE, số 70666), thẩm tách chống lại PBS và được bảo quản ở –80 ° C.
Đối với xét nghiệm cận nhãn in vitro dựa trên kháng thể, trộn 100 μM miniSOG tinh khiết, 1 mM đầu dò 3 và 1 μg kháng thể đơn dòng chuột chống nhãn (TransGen, # HT501-01) trong PBS đến tổng thể tích phản ứng là 50 μl..Hỗn hợp phản ứng được chiếu xạ bằng ánh sáng LED xanh lam trong 0, 2, 5, 10 và 20 phút ở nhiệt độ phòng.Hỗn hợp này được ủ với 0,1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, # B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM phối tử TBTA và 1 mM CuSO4 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc chuyển động hướng lên.Sau phản ứng nhanh, thêm trực tiếp 4x dung dịch đệm Laemmli vào hỗn hợp và đun sôi ở 95 ° C trong 10 phút.Các mẫu được phân tích trên gel SDS-PAGE và được phân tích bằng phương pháp thấm phương tây với streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, # SE068).
Một peptit tổng hợp có chứa histidin có amid hóa ở đầu C (LHDALDAK-CONH2) được sử dụng để phân tích việc ghi nhãn trong ống nghiệm dựa trên peptit gần đó.Trong thử nghiệm này, 100 μM miniSOG tinh khiết, 10 mM đầu dò 3 và peptit tổng hợp 2 μg / ml được trộn trong PBS với tổng thể tích phản ứng là 50 μl.Hỗn hợp phản ứng được chiếu bằng ánh sáng LED xanh lam trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.Một microlit mẫu được phân tích bằng hệ thống LC-MS (Máy đo khối phổ Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight với phần mềm phân tích phổ MassLynx).
Các tế bào HEK293T biểu hiện ổn định gen dung hợp miniSOG được gieo hạt trong các đĩa 10 cm cho các dòng có bản địa hóa bào quan khác nhau (Mito, ER, Nucleus) và các đĩa 15 cm cho các dòng Parkin-miniSOG và BRD4-miniSOG.Khi đạt đến độ hợp lưu ~ 90%, các tế bào được rửa một lần bằng HBSS, sau đó được ủ với đầu dò 3 trong HBSS trong 1 giờ ở 37 ° C và được chiếu sáng bằng đèn LED màu xanh lam 10 W ở nhiệt độ phòng.Để ghi nhãn không tiếp xúc với Parkin, chất mang 10 µM proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, # C6700) với đầu dò 3 trong HBSS đã được thêm vào trong 1 giờ ở 37 ° C.Các bước ly giải tế bào, hóa học nhấp nháy, khử và alkyl hóa giống như mô tả ở trên, ngoại trừ 2 mg lysate được thêm vào và biotin PEG3 azide được sử dụng trong phản ứng nhấp chuột thay vì azide biotin có thể phân hủy quang học.Sau khi làm giàu, các hạt được rửa 3 lần với 5 ml PBS chứa 0,2% SDS, 3 lần với 5 ml PBS chứa 1 M urê, và 3 lần với 5 ml PBS.Sau đó, 2 µg trypsin được thêm vào 300 µl 25 mM ABC chứa 1 M urê để phân cắt protein qua đêm ở 37 ° C.Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm axit fomic cho đến khi đạt được pH bằng 2-3.Sau khi tạo trypin trên các hạt, dung dịch peptit được khử muối bằng cột SOLAµ HRP (Thermo, # 60209-001) và được làm khô trong thiết bị cô đặc chân không Speedvac.Các peptit được hòa tan lại trong axit formic 0,1% và 500 ng peptit được phân tích bằng máy quang phổ khối lượng Orbitrap Fusion Lumos Tribrid được trang bị nguồn ESI nano được mô tả ở trên.Các peptit được phân tách trên cột RP-HPLC thương mại (75 μm x 2 cm) (Thermo, số 164946) và cột RP-HPLC phân tích (75 μm x 25 cm) (Thermo, số 164941), cả hai đều được lấp đầy 2 μm.gradient từ 8% đến 35% ACN trong 60 phút, sau đó tăng tuyến tính lên 98% B trong 6 phút với tốc độ dòng 300 Nl / phút.Phổ MS (350-1500 m / z) được thu thập với độ phân giải 60.000, AGC 4 × 105 và thời gian đầu vào tối đa là 50 ms.Các ion đã chọn được phân mảnh liên tiếp bởi HCD trong chu kỳ 3 s với năng lượng va chạm chuẩn hóa là 30%, cửa sổ cách ly tứ cực là 1,6 m / z và độ phân giải là 15000. Mục tiêu AGC của máy quang phổ khối 5 × 104 và thời gian phun tối đa 22 ms đã được sử dụng.Loại trừ động được đặt thành 45 giây. Các ion không được chỉ định hoặc những ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS. Các ion không được chỉ định hoặc những ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. Các ion không được chỉ định hoặc các ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS.未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. Các ion không xác định hoặc các ion có điện tích 1+ và> 7+ bị loại bỏ đối với MS / MS.
Các bước chuẩn bị mẫu để làm giàu các hạt NeutrAvidin cũng giống như trong phân tích LC-MS / MS được mô tả ở trên.Khoảng 50 μg lysate được sử dụng làm đầu vào để kiểm soát tải và 2 mg lysate được sử dụng cho các phản ứng nhấp chuột.Sau khi làm giàu và rửa bằng neutravidin, các protein liên kết được rửa giải bằng cách thêm 50 μl đệm Laemmli vào hạt nhựa agarose và đun sôi ở 95 ° C trong 5 phút.Đầu vào tải kiểm soát và các mẫu được làm giàu hạt được phân tích bằng SDS-PAGE và chuyển sang màng PVDF (Millipore, # ISEQ00010) bằng phương pháp Western blot tiêu chuẩn.Các màng được chặn bằng sữa tách béo 5% (Sangon, # A600669) trong TBS chứa 0,1% tween-20 (TBST) và được ủ tuần tự với các kháng thể chính và phụ.Các kháng thể sơ cấp được pha loãng 1: 1000 trong sữa tách béo 5% trong TBST và ủ qua đêm ở 4 ° C.Các kháng thể thứ cấp được sử dụng theo tỷ lệ 1: 5000 và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.Các màng được hình dung bằng phát quang hóa học sử dụng hệ thống hình ảnh Chemidoc MP.Tất cả các bản quét đốm và gel chưa cắt trong hình được trình bày dưới dạng dữ liệu thô.
Các kháng thể chính được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm kháng thể đơn dòng kháng SFPQ ở thỏ (CST, số 71992), kháng thể đơn dòng chống FUS ở thỏ (CST, số 67840), kháng thể đa dòng kháng NSUN2 ở thỏ (Proteintech, số 20854-1- AP), kháng thể đa dòng kháng mSin3A ở thỏ (Abcam, # ab3479), kháng thể đơn dòng chống thẻ của chuột (TransGen, # HT201-02), kháng thể đơn dòng kháng β-actin của chuột (TransGen, # HC201-01), kháng ở thỏ Kháng thể đơn dòng -CDK2 (ABclonal, # A0094), kháng thể đơn dòng của thỏ với CTBP1 (ABclonal, # A11600), kháng thể đa dòng của thỏ đối với DUT (ABclonal, # A2901), kháng thể đa dòng của thỏ đối với PSMC4 (ABclonal, # A2505), kháng của thỏ Kháng thể đa dòng DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Các kháng thể này được sử dụng ở độ pha loãng 1: 1000 trong sữa tách béo 5% trong TBST.Các kháng thể thứ cấp được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm IgG chống thỏ (TransGen, # HS101-01), IgG chống chuột (TransGen, # HS201-01) ở độ pha loãng 1: 5000.
Để nghiên cứu thêm xem BRD4 có tương tác với SFPQ hay không, các tế bào HEK293T và BRD4-miniSOG ổn định biểu hiện quá mức HEK293T đã được mạ trong các đĩa 10 cm.Tế bào được rửa bằng PBS lạnh và được ly giải trong 1 ml đệm ly giải Pierce IP (Thermo Fisher, # 87787) với chất ức chế protease không có EDTA trong 30 phút ở 4 ° C.Sau đó, dịch ly tâm được thu vào ống ly tâm 1,5 ml và ly tâm ở 15,871 xg trong 10 phút ở 4 ° C.Phần nổi phía trên được thu hoạch và ủ với 5 µg kháng thể đơn dòng chuột được đánh dấu kháng V5 (CST, # 80076) qua đêm ở 4 ° C.Rửa khoảng 50 µl hạt từ tính protein A / G (MCE, # HY-K0202) hai lần bằng PBS chứa 0,5% Tween-20.Sau đó, tế bào ly giải được ủ với hạt từ tính trong 4 giờ ở 4 ° C với sự quay từ dưới lên trên.Sau đó, các hạt được rửa bốn lần với 1 ml đệm PBST và đun sôi ở 95 ° C trong 5 phút.Các mẫu được phân tích trên gel SDS-PAGE và được chuyển sang màng PVDF bằng phương pháp Western blot tiêu chuẩn.Các màng được chặn trong sữa tách béo 5% trong TBST và được ủ tuần tự với các kháng thể sơ cấp và thứ cấp.Kháng thể chính Kháng thể đơn dòng kháng SFPQ của thỏ (CST, # 71992) được sử dụng với tỷ lệ 1: 1000 trong sữa tách béo 5% trong TBST và ủ qua đêm ở 4 ° C.IgG kháng thỏ được sử dụng với tỷ lệ 1: 5000 và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.Các màng được hình dung bằng phát quang hóa học sử dụng hệ thống hình ảnh Chemidoc MP.
Tất cả các cấu trúc được sử dụng cho phân tích Diện tích Bề mặt Tiếp cận Dung môi (SASA) được lấy từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB) 52 hoặc Cơ sở dữ liệu Cấu trúc Protein AlphaFold53.SASA tuyệt đối được tính toán cho mỗi dư lượng bằng cách sử dụng chương trình FreeSASA.Chỉ dữ liệu SASA đầy đủ và rõ ràng cho histidine được gắn nhãn và các nước láng giềng của nó được sử dụng để lấy SASA trung bình cho mỗi cấu trúc.Khả năng tiếp cận dung môi tương đối (RSA) đối với mỗi histidine được tính bằng cách chia giá trị SASA tuyệt đối cho diện tích bề mặt dư lượng tối đa có thể có theo kinh nghiệm có sẵn cho dung môi.Tất cả các histidine sau đó được phân loại là ẩn nếu RSA trung bình dưới 20%, nếu không thì bị phơi nhiễm56.
Các tệp thô thu được ở chế độ DDA được tìm kiếm bằng Proteome Discoverer (v2.5) hoặc MSfragger (Fragpipe v15.0) trong cơ sở dữ liệu protein đã được SwissProt xác minh có chứa các chất gây ô nhiễm phổ biến.Các peptit yêu cầu trypsin hoàn chỉnh với hai vị trí phân cắt bị thiếu, metyl hóa cacbamoyl như một biến đổi cố định và oxy hóa methionin như một biến đổi động.Dung sai trọng lượng đoạn trước và khối lượng mảnh được đặt thành 10 ppm và 0,02 Da (MS2 Orbitrap), tương ứng. Các lượt truy cập có tạp chất đã bị loại bỏ và các protein được lọc để thu được tỷ lệ phát hiện sai là <1%. Các lượt truy cập có tạp chất đã bị loại bỏ và các protein được lọc để thu được tỷ lệ phát hiện sai là <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициценоя <1 Các lượt truy cập nhiễm bẩn đã được loại bỏ và các protein được lọc để có tỷ lệ phát hiện sai là <1%.去除 污染物 命中 ， 过滤 蛋白质 以 获得 <1% 的 错误 发现 率。 <1% 的 错误 发现 率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достиженния уровня лебния уровня лебний уроных л л. Các lượt truy cập nhiễm bẩn được loại bỏ và lọc protein để đạt được tỷ lệ dương tính giả <1%.Để phân tích định lượng mà không cần sử dụng nhãn, hàm lượng protein chuẩn hóa từ ba lần lặp lại sinh học đã được sử dụng.Phân tích bản địa hóa dưới tế bào của protein được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích Gene Ontology (GO) từ DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 và cơ sở dữ liệu do nhóm Alice Ting biên soạn và xuất bản.Bản đồ núi lửa được lấy từ Perseus (v1.6.15.0). Sự thay đổi nếp gấp về độ phong phú của protein được kiểm tra về ý nghĩa thống kê bằng cách sử dụng thử nghiệm t hai mặt và các lần truy cập protein được xác định với sự thay đổi về độ phong phú> 2 (trừ khi có quy định khác) và giá trị p <0,05. Sự thay đổi nếp gấp về độ phong phú của protein được kiểm tra về ý nghĩa thống kê bằng cách sử dụng thử nghiệm t hai mặt và các lần truy cập protein được xác định với sự thay đổi về độ phong phú> 2 (trừ khi có quy định khác) và giá trị p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Sự thay đổi nếp gấp hàm lượng protein đã được kiểm tra về ý nghĩa thống kê bằng cách sử dụng thử nghiệm t hai phía và các kết quả phù hợp với protein được xác định với sự thay đổi hàm lượng> 2 (trừ khi có ghi chú khác) và giá trị ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰 度 倍数 变化 的 统计 显 着 性 ， 并 确定 蛋白质 命中 的 丰 变化> 2 （除非 另有 说明） 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显 着 性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰 度> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Ý nghĩa thống kê của những thay đổi lần lượt trong hàm lượng protein đã được kiểm tra bằng cách sử dụng phép thử t hai phía, và độ trùng khớp của protein được xác định đối với sự thay đổi hàm lượng> 2 (trừ khi có chỉ định khác) và giá trị p <0,05.Phân tích tương tác protein được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích GO cùng với cơ sở dữ liệu Chuỗi.
Ba lần lặp lại sinh học được thực hiện với kết quả tương tự.Phân tích thống kê được thực hiện bằng GraphPad Prism (phần mềm GraphPad) và các đồ thị núi lửa được tạo bằng Perseus (v1.6.15.0).Để so sánh hai nhóm, giá trị p được xác định bằng phép thử t của Sinh viên hai phía.Chỉ các protein đơn lẻ được xác định ít nhất hai lần trong nhóm thử nghiệm mới được đưa vào đồ thị núi lửa và các giá trị còn thiếu tương ứng trong nhóm đối chứng được thay thế bằng Perseus từ phân phối chuẩn để có thể tính được giá trị p.Các thanh lỗi thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.Trong phân tích proteomic để phân tích thống kê, lượng protein phong phú xuất hiện trong ít nhất hai lần sao chép sinh học được giữ lại.Phương pháp thống kê không được sử dụng để xác định trước cỡ mẫu.Các thí nghiệm không phải là ngẫu nhiên.Các nhà nghiên cứu đã không mù mờ với các nhiệm vụ trong quá trình thử nghiệm và đánh giá kết quả.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, hãy xem phần tóm tắt Báo cáo Nghiên cứu Tự nhiên được liên kết với bài viết này.
Dữ liệu khối phổ thu được trong nghiên cứu này đã được đệ trình tới ProteomeXchange Consortium thông qua kho đối tác iProX57 theo tập dữ liệu ID PXD034811 (tập dữ liệu PDPL-MS).Dữ liệu thô được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.Bài báo này cung cấp dữ liệu gốc.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Làm quen với vùng lân cận: sử dụng quá trình phân tích sinh học phụ thuộc vào vùng lân cận để xác định đặc điểm của phức hợp protein và lập bản đồ các bào quan. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Làm quen với vùng lân cận: sử dụng quá trình phân tích sinh học phụ thuộc vào vùng lân cận để xác định đặc điểm của phức hợp protein và lập bản đồ các bào quan.Gingras, AS, Abe, KT và Raut, B. Quen thuộc với môi trường xung quanh: sử dụng quá trình đánh dấu biotin phụ thuộc vào vùng lân cận để xác định đặc điểm của phức hợp protein và lập bản đồ các bào quan. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解 邻里 ： 使用 邻近 依赖性 生物 素 化 来 表征 蛋白质 复合 物 并 绘制 细胞 器 图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Tìm hiểu vùng lân cận: sử dụng sự phụ thuộc của vùng lân cận vào đời sống sinh vật.Gingras, AS, Abe, KT và Raut, B. Tìm hiểu về sự gần gũi: mô tả đặc điểm của phức hợp protein và lập bản đồ của các bào quan bằng cách sử dụng biotinyl hóa phụ thuộc vào khoảng cách gần nhau.Hiện hành.Ý kiến ​​cá nhân của tôi.Hóa học.sinh học 48, 44–54 (2019).
Geri, JB và cộng sự.Lập bản đồ vi môi trường bằng cách truyền năng lượng Dexter đến các tế bào miễn dịch.Khoa học 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL và cộng sự.Mạng quy mô hai proteome phát hiện quá trình tái cấu trúc tế bào cụ thể của quần thể tương tác của con người.Ô 184, 3022–3040.e3028 (2021).